w
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. 1995, >т>м 21, М I, с.9 - 16
УДК 577.214.622
ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ВЕКТОРЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В ВИДЕ ГИБРИДОВ С МЕГАЛЛСВЯЗЫВАЮЩИМИ ПЕПТИДАМИ
© 1995 г. В, А. Ефимов*, А. Ф. Фрадков, А. JL Калинкнна, О. Г. Чахмахчева
Институт биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва 1 1787I, ул. Миклухо-Маклая, 16110 Поступила в редакцию 01.03.94 г.
Сконструированы нлазмидньш векторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии в клетках Е. coli генов гетерологичных полипелтидов и белков в составе гибридов с пептидами, содержащими гомогистидиновый кластер. С помощью полученных векторов осуществлена экспрессия генов стрептавидина, проинсулина и кальцитонина. Для выделения гибридных белков использована аффинная хроматография на колонках с никель-агароаой.
Ключевые слова: рекомСинанпшые поли пептиды, гибридные белки, металлсвязывшощие пептиды, аффинная хроматография.
Появившееся в последние годы новое направление физико-химической биологии - белковая инженерия, с одной стороны, помогает решить вопросы структурно-функциональных отношений в белках и нуклеиновых кислотах, а с другой -предоставляет возможности для производства больших количеств ценных с практической точки зрения пептидов и белков с помощью микробиологического синтеза. Характерным примером практической белковой инженерии является получение нестабильных в бактериях гетерологичных полипептидов и белков в виде стабильных гибридов с бактериальными белками, их фрагментами или короткими гомопептидами [1]. Достоинство такого метода заключается в том, что эффективность биосинтеза целевого белкового продукта определяется областью инициации трансляции бактериального гена, в структурную часть которого встраивается чужеродный фрагмент ДНК, а стабильность гибридного белка достигается либо за счет его способности образовывать в цитоплазме клеток нерастворимые тела включения, либо за счет секреции в периплазмати-ческое пространство клетки или кудьтуральную среду, что обеспечивается сигнальными последовательностями лидеров. При этом практическая ценность соответствующего штамма-продуцента зависит от ряда факторов, главными из которых являются его высокая продуктивность, а также технологичность процесса выделения и очистки
Испольчоианиые сокращении: CT - кальцитонин, PI - про-инсулин, StV - стрептапидин, His - гомогистидиновый пептид. IPTG - изопропил-р-О-тиогалактопиранозид, ПААГ-иолкячриламиднмй i ель, SDS — додецилсульфат натрия.
* Автор для переписки.
целевого продукта. Оба эти фактора в большой степени определяются конструкцией введенного в бактериальные клетки экспрессиругащего вектора, несущего ген целевого белка. Поэтому создание новых векторных систем, удобных для клонирования и экспрессии генов, является одним из основных направлений в современной генетической инженерии.
Ранее с применением синтетических олиго- и полинуклеотидов нами была получена серия плазмид для клонирования фрагментов ДНК [2J, а также ряд векторов для оценки силы промоторов [3] и экспрессии в бактериальных клетках генов небольших белков [4]. В частности, была изучена экспрессия в Е. coli проинсулина человека -биосинтетического предшественника гормона инсулина. Инсулин и кальцитонин - гормональный биорегулятор обмена кальция и фосфора в организме - являются примерами белков, возрастающее значение которых для медицинской практики ставит на повестку дня проблему разработки и освоения новых методов их получения микробиологическим путем [5, 6]. На основе синтетического гена проинсулина нами был сконструирован ряд рекомбинантных плазмид, предусматривающих как прямую его экспрессию, так и получение прогормона в составе гибридных белков, а также разработаны схемы выделения этого полипептида из биомассы [7J.
Настоящее сообщение посвящено конструированию новой серии плазмид, предназначенных для получения в клетках Е. coli гетерологичных пептидов и белков в виде не существующих в природе химерных белков, очистка которых возможна
с помощью аффинной хроматографии. В работе приводятся некоторые результаты, полученные и;ши при изучении экспрессии проинсулина и кальцитонина человека, а также стрептавидина из Streptomyces avidinii в этих векторных системах.
Известен ряд общепринятых процедур для очистки рекомбинантных полипептидов, синтезирующихся в клетке в виде гибридных белков [I ]. Одним из эффективных методов является аффинная хроматография, применение которой обычно предполагае т присоединение к целевому полипептиду фрагмента какого-либо белка или пептида, способного аффинно связываться с закрепленным на твердом носителе лигандом [8]. Ранее с этой целью нами были использованы экс-прессирующие системы на основе генов IgG-свя-зывающего фрагмента белка А стафилококков [9] и альбуминсвязывающего фрагмента белка G стрептококков [10]. Были получены штаммы Е. coli - продуценты проинсулина, минипроинсу-лина и кальцитонина в виде гибридных белков с lgG-связывающнм доменом белка А, выделение которых из бактериальной массы осуществлялось аффинной хроматографией на IgG-сефа-розе [9, Л].
Недавно Р. Кантором и сотр. [12] было показано, что клонированный ген Stv может быть эффективно экспрессирован в Е. coli под контролем промотора Т7-РНК-полимеразы несмотря на то, что образование продукта должно быть летально для клетки-хозяина вследствие связывания им биотина. В ходе проведенных исследований мы модифицировали использованную в работе Р. Кантора плазмиду pTSA-18F введением в нее нового поли-линкерного участка (дуплекс 1, схема). Полученный при этом вектор pTSA-Ml содержал последовательность ДНК, кодирующую "core" молекулы стрептавидина (16 - 133 а. о.), на З'-конце которой находились уникальные сайты узнавания нескольких эндонуклеаз рестрикции (рис. 1). Введением в эту плазмиду между EcoRI- и Я/7гс1Ш-сайтами синтезированных нами ранее генов [Val8]CT или проинсулина (последовательности генов приведены в работах [II, 13, 14]) были получены соответственно векторы pTSA-CT и pTSA-PI. Следует отметить, что в данном случае были использованы варианты генов кальцитонина и проинсулина человека, содержащие между £соК1-сайтом и первым кодоном триплет метио-нина, что предусматривает выщепление PI и СТ из гибридных белков действием бромциана.
EcoRI* Bglil BamHI EcoKI Smal Sali
5' AATTTAGATCTGGATCCAGAATTCATGCCCGGGTAA8 дуплекс 1
ATCTAGACCTAGGTCTTAAGTACGGGCCCATTCAGCT 5' '
NdeJ Ndel
MetAlaSerlleHisHisHisHisHisHisAsp
5' TATGGCTAGCATCCATCACCATCACCATCACGA дуплекс 2
ACCGATCGTAGGTAGTGGTAGTGGTAGTGCTAT 5'
BamHI EcoRI
AspProHisHisHisHisHisHisGlu 5' G АТС CA CATCACC АТС ACC АТС ACG дуплекс 3
GTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCTTAA 5'
Ndel Bglll
MetAlaSerliisHisH isHisHisHisLys 5' TATGGCTAGCCACCATCACCATCACCATAAA дуплекс 4
CGATCGGTGGTAGTGGTAGTGG'l ATTTCTAG 5'
Экспрессия генов СТ и химерных белков Stv-CT дуры, включающей разрушение клеток, отделе-и Stv-PI изучалась в штамме Е. coli BL21 (DE3), не- ние нерастворимой белковой фракции центрифу-сущем в хромосоме ген Т7-РНК-полимеразы под гированием, солюбилизапию целевых гибридных контролем lac-промотора. Анализ суммарного белков в 6 М гуанидингидрохлориде (рН 1.5) и неклеточного белка штаммов Е. coli BL21/pTSA-Ml, сколько последовательных диализов. Согласно BL21/pTSA-CT, ВL21/pTSA-PI показал, что как работе [12], при этом должно происходить разру-сам стрептавидиновый "core", так и его гибриды с шение комплекса стрептавидина с биотипом из кальцитонином и проинсулином эффективно син- клеток Е. coli, в результате чего становится воз-тезировались в бактериальных клетках и накап- можной окончательная очистка целевых гибри-ливались там в виде тел включения с выходом до дов аффинной хроматографией с использовани-30 - 35% от общего количества белка уже через ем в качеСтве лиганда 2-иминобиотина. Однако несколько часов после индукции 1PTG (рис. 2). выход гибрИдных белков после этой длительной Содержащие стрептавидин рекомбинантные процедуры оказался сравнительно невысок. Как белки выделяли из биомассы с помощью проце- показала проверка белковых фракций электро-
.Sph I „ Sal I - Sma 1 ~ EcoK I ~~BamH I Bgl II
2. Дуплекс 1, ДНК-лигаза
Nde I
1. EcoK I, Hind ПГ
2. Ген CT (PI) ДНК-лигаза
X Bgl II
1. Bamti I, EcoR I
2. Дуплекс 3, ДНК-лигаза
2. Дуплекс 2, ДНК-лигаза
Hind III .Sph I
V &?/1
(— 5>ИЙ I Г EcoK I / Baml 11 ^BglU
Hind III
. I
V Sa/1 l— 5/wa ! J-EcoR I J~ BamH I П
pTSA -PI2 (pTSA-CT2) pTSA-PD (pTSA-CT3)
Рис. 1. Схемы конструирования экспрессирующих векторов для получения гибридных белков, содержащих стрепта-видин и полигистидиновый домен. 010 - промотор гена !0 бактериофага Т7, 0Т - Т7-терминатор, slv - ген стрелта-видина, his - фрагмент ДНК, кодирующий гомогистидиновый пептид.
форезом в полиакриламидном геле с последующим иммуноблотингом, основная часть целевого гибрида не задерживалась на колонке при нанесении - по-видимому, вследствие сохранения комплекса стрептавидина с биотином. Повторная обработка белковой фракции кислым гуанидин-гидрохлоридом, диализ и хроматография на ими-нобиотин-агарозе приводили к очистке очередной порции целевого белка, однако полного его выделения из биомассы достичь не удавалось. Поэтому для выделения стрептавидина и его гибридных белков с кальцитонином и проинсулином из клеточных экстрактов нами была использована традиционная методика, включающая применение таких процедур, как осаждение, центрифугирование и ультра фильтрация [7].
Свойство химерных белков плохо растворяться в воде и солевых растворах, с одной стороны, позволяет резко повысить их выход в бактериальных клетках и упростить процедуру очистки, а с другой - затрудняет их выделение аффинной хроматографией, поскольку белки способны растворяться только в концентрированных рас творах таких денатурирующих агентов, как гуа-нидингидрохлорид и мочевина.
Дальнейшее развитие исследований привело нас к использованию для очистки гибридных белков металл-хелатпой хроматографии, которая получила в последнее время достаточно широкое распространение 115]. Рядом авторов было показано, что после присоединения к стационарной фазе ионы некото
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.