ш
УДК 571.27
ЭКСПРЕССИЯ АЛЛЕРГЕНОВ КЛЕЩЕЙ ДОМАШНЕЙ ПЫЛИ Der f 1 И Der f 2 В ЛИСТЬЯХ NICOTIANA BENTHAMIANA
© 2014 г. Д. Ю. Рязанцев*, #, П. Е. Дробязина*, **, C. В. Хлгатян***, С. К. Завриев*, Е. В. Свирщевская*
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии (ВНИИСБ РАСХН), Москва ***ФГБУ "Научно-исследовательский Институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова"РАМН, Москва Поступила в редакцию 04.10.2013 г. Принята к печати 04.03.2014 г.
В тест-системах для диагностики аллергии типа I используют рекомбинантные аллергены, имеющие нативную конформацию, поскольку иммуноглобулины класса E (IgE), отвечающие за развитие этого типа аллергии, распознают конформационные эпитопы белков-аллергенов. Для получения рекомбинантных аллергенов клещей домашней пыли (КДП) Dermatophagoides farinae Der f 1 и Der f 2 применили две системы гетерологичной экспрессии: Es^eri^ia coli и растения Nicotiana benthami-ana. Показано, что IgE из сывороток больных детей с аллергией к КДП распознают рекомбинантный белок Der f 2, синтезированный как в E. саИ, так и в растениях N. benthamiana, а также рекомбинантный белок Der f 1, полученный в N. benthamiana, в то время как зрелая форма Der f1, полученная в E. mli, не взаимодействует с IgE.
Ключевые слова: аллергия, клещи домашней пыли, Der f 1, Der f 2, агроинфильтрация, иммуноглобулин E.
DOI: 10.7868/S0132342314040113
ВВЕДЕНИЕ
Аллергены из клещей домашней пыли (КДП) Dermatophagoides farinae и D. pteronyssinus широко распространены и ассоциированы с аллергическими реакциями гиперчувствительности, такими как многолетние риниты, атопический дерматит и астма [1, 2]. Насчитывается более 20 белков из КДП, которые распознаются иммуноглобулинами класса Е (IgE) из сывороток больных аллергией [http://www.allergen.org, 2, 3]. Аллергены группы I из КДП (Der p 1 и Der f 1), выделенные из экскрементов клещей, относятся к семейству цистеиновых протеиназ, сходных с папаином [1]. Наиболее хорошо изучен Der p 1 (30 кДа), который синтезируется как неактивный белок-предшественник (proDer p 1) размером 320 а.о., включающий сигнальный пептид (18 а.о.) и пропетид (80 а.о.), необходимый для правильного формирования пространственной структуры белка. ProDer p 1 содержит два сайта N-гликозилирования (Asn52 и Asn150), играющих ключевую роль в фермента-
Сокращения: КДП — клещи домашней пыли; СИТ — специфическая иммунотерапия; ^Е — иммуноглобулины класса Е.
#Автор для связи (тел.: +7 (495) 33-64-511; эл. почта: d.yu.ryazantsev@gmail.com).
тивной активности этого белка и в созревании аллергена [4—8]. Остаток цистеина в положении 132 также необходим для аллергенности [6, 9]. Показано, что у аллергенов КДП группы I имеются только конформационные эпитопы связывания IgE [10], а пропептид блокирует некоторые из них [4]. Более 80% пациентов с аллергией к КДП вырабатывают IgE к аллергенам группы I. Так как гомология аминокислотных последовательностей Der p 1 и Der f1 составляет 81%, на эти аллергены наблюдается перекрестный IgE- и Т-клеточ-ный ответ [11].
Аллергены группы II КДП (Der p 2 и Der f 2) в большом количестве присутствуют в фекалиях клещей [12], предположительно играют роль в их размножении и на 35% гомологичны белку HE1 придатка яичка человека [13]. Наиболее изученный белок Der p 2 имеет небольшой размер 14 кДа (129 а.о.). Аллергены группы II также относятся к основным аллергенам КДП, так как 80—90% пациентов с аллергией к КДП проявляют гуморальный и клеточный ответ на эти белки [12]. Показано, что B-клеточные эпитопы аллергенов группы II температуро- и pH-устойчивы [10]. Анализ связывания пептидов, входящих в состав этих белков, с IgE показал их минимальную IgE-реактив-
Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, использованных в работе
№ п.п. Название Последовательность, 5'-3' T °C
1 matDerf1F ACAAGCGCTTGCCGTATC 62
2 proDerf1F CGTCCAGCTTCAATCAAAACT 61
3 Derf1R TCACATGATTACAACATATGGATATT 58
4 Derf2F GATCAAGTCGATGTTAAAGATTGT 58
5 Derf2R TTAATCACGGATTTTACCATGG 58
6 Df1BamHIF ATCCGGATCCACAAGCGCTTGCCGTATC 69
7 Df1PstIR CGACTGCAGTCACATGATTACAACATATGGATATT 68
8 Df2BamHIF ATCCGGATCCGATCAAGTCGATGTTAAAGATTGT 58
9 Df2PstIR CGACTGCAGTTAATCACGGATTTTACCATGG 60
10 DF1PrSPNru GCTTTCGCGAATGAACTTCCTCAAAAGCTTCCCCTTTTATG CCTTCCTTTGTTTTGGCCAATACTTTGTAGCTGTTACTCATG CTCGTCCAGCTTCAATCAAAACTTT 68
11 Df1hisSal CTGCAGGTCGACTCAGTGGTGATGGTGATGGTGATGGTGAT GGTGATGGTGATGGTGATGCATGATT 68
12 DF2SPNru ATGCTCGCGAGATCAAGTCGATGTTAAAGATTGT 58
13 Df2hisSal GCATTCAGTCGACTTAGTGGTGATGGTGATGGTGATGGTGA TGATCACGGATTTTACCATGG 58
ность, подтверждая, что IgE-эпитопы на Der p 2 формируются третичной структурой белка, то есть являются дискретными (пространственными) эпитопами [14, 15]. Было показано, что разрушение любой из трех дисульфидных связей в Der f 2 существенно влияет на связывание IgE [16]. В отличие от Der p 1, белок Der p 2 не гликозили-рован, представлен в виде мономера и хорошо экспрессируется в E. coli [17].
Аллергены КДП применяются в медицинской практике при проведении специфической иммунотерапии (СИТ), а также в диагностике аллергических заболеваний. Ранее в вакцинах для СИТ использовали экстракты аллергенов из природных источников [2, 18, 19]. В настоящее время все более широкое распространение получают вакцины на основе очищенных рекомбинантных аллергенов, которые могут быть получены в больших количествах в легко стандартизуемых условиях как в нативной конформации, имитирующей природные аллергены, так и с модификациями, приводящими к снижению IgE-реактивности и риска возникновения анафилактического шока [19—21]. Ре-комбинантные аллергены КДП, полученные в E. mli и не обладающие способностью связывать IgE, могут быть использованы при разработке препаратов для СИТ. Для создания диагностику-мов, наоборот, требуются белки с нативной кон-формацией. Современные методы молекулярной биологии позволяют успешно решать обе эти задачи за счет использования различных экспрес-сирующих систем: E. coli, дрожжевых и эукарио-
тических систем (клеток млекопитающих или растений, трансгенных растений).
В настоящей работе для получения рекомби-нантных аллергенов КДП нами использованы две системы экспрессии: бактерии E. coli и растения N. benthamiana. В обеих системах экспрессирова-ли рекомбинантные гены основных аллергенов (Der f 1 и Der f 2) американского клеща D. farinae. Оценку нативности конформации аллергенов, полученных в разных экспрессирующих системах, проводили по их способности связывать IgE из сывороток больных с аллергией к КДП.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение последовательностей мРНК, кодирующих Der f1 и Der f 2
Для получения последовательностей ДНК, кодирующих белки Der f 1 и Der f 2, использовали суммарную РНК, выделенную из живых клещей D. farinae. В результате обратной транскрипции с праймером d(T)18 и последующей амплификации со специфичными парами праймеров (табл. 1, пары праймеров №№ 1, 3 и 2, 3 — для зрелой и незрелой форм Der f1, соответственно, № 4, 5 — для Der f 2) для каждого из аллергенов были получены по два ампликона, различающихся электрофоре-тической подвижностью (рис. 1в). Каждый из них был клонирован в вектор pTZ57R/T для определения нуклеотидной последовательности. Полученные последовательности сопоставлены с гомологами из баз данных UniProtKB/Swiss-Prot и NCBI (рис. 1а, б). Оказалось, что все последова-
Р16311 Der f 1 111
(19) RPASIKTFEEFKKAFNKNYATVEEEEVARKNFLESLKYVEANKGAINHLSDLSLDEFKNRYLMSAEAFEQLKTQF (19) RPASIKTFEEFKKAFNKNYATVEEEEVARKNFLESLKYVEANKGAINHLSDLSLDEFKNRYLMSAEAFEQLKTQF
P1G311 (94) DLNAET5ACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRHQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSE0ELVDCAS0H
Der_f_l_lll (94) DLNAETSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEOELVDCASOH
P16311 (169) GCHGDTIPRGIEYIQQNGWEERSYPYVAREQRCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGI
Der_f_l_lll (169) GCHGDTIPRGIEYIQQNGWEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGI
P16311 (244) KDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGDDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYV
Der_f_l_lll (244) KDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPPJYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYV
P16311 (319) VIM
Der f 1 111 (319) VIM
(б)
Der_f_2_215 AAK30133 ABU68318 Der_f_2_221 Q00855
Der_f_2_215 AAK30133 ABU68318 Der_f_2_221 000855
Der_f_2_215 AAK3Q133 ABU68318 Der_f_2_221 000855
(1} DQVDVKDCGKFVCVIHFFSFHLFNTKHNFLFLVYIHIANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQN (1) DQVDVKDCGKFVCVIHFFSFHLFNTKHNFLFLVYIHIANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANON (1) DQVDVKDCGKFVCVIHFFSFHLFNTKHNFLFLVYIHIAMNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQN
(1) DQVDVKDC.............................ANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQN
(1) DQVDVKDC-............................ANNEIKKVMVDGCHG5DPCIIHRGKPFTLEALFDANQN
(76) TKTAKIEIKA5LDGLEIDVP&IDTNACHF|KCPLVKGQQYDIKYTWJVPKIAPKSENVWTVKLIGDNGVLACAI (76} TKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTMACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWMVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACAI (76) TKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWJVPKIAPKSENWVTVKLIGDNGVLACAI (47) TKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHF|KCPLVKGQQYDIKYTWJVPKIALKSENVVVTVKLIGDNGVLACAI (47) TKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACAI
(151) ATHGKIRD
(151) ATHGKIRD
(151) ATHGKIRD
(122) ATHGKIRD
(122) ATHGKIRD
100 п.о. 500 п.о.
Рис. 1. Сравнительный анализ рекомбинантных аллергенов Der f 1 (клон Der f 1_111) и Der f 2 (клоны Der f 2_221 и Der
f 2_215). Выравнивание аминокислотных последовательностей proDer f1 (а) и Der f 2 (б) без сигнального пептида (18 а.о.) с гомологами из баз данных UniProtKB/Swiss-Prot и NCBI. Серым цветом выделены полиморфные аминокислотные остатки. (в) — Электрофореграмма продуктов амплификации нуклеотидных последовательностей кДНК, кодирующих Der f 2 (1) и Der f 1 (2). M — маркер молекулярной массы GeneRuller 1 Kb DNA LadDer plus.
тельности ДНК, кодирующие Der f 1_111, имеют
по 2 несинонимичные нуклеотидные замены, приводящие к следующим аминокислотным заменам: R201Q и D282V (рис. 1а). При эт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.