РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012, том 6(15), № 2, с. 124-131
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
ЭКСПРЕССИЯ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ TLRs В ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТКАХ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ИНАКТИВИРОВАННЫХ И ЖИВЫХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН В СОЧЕТАНИИ С ХИТОЗАНОМ
© 2012 г. Н.К. Ахматова, С.Г. Маркушин, Э.А. Ахматов, Е.В. Сорокина, В.Г. Хоменков, А.С. Сухно, А.Д. Переверзев, В.В. Зверев
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия Поступила: 27.02.2012. Принята: 11.05.2012
В предыдущих работах нами было показано, что иммунизация инактивированными гриппозными и полиовирусными вакцинами в комбинации с производными хитозана в качестве адъюванта приводит к поляризации иммунного ответа по типу [1, 2]. Одним из возможных механизмов такой поляризации могла быть повышенная активация эндосомальных TLRs под влиянием вирусных антигенов в комбинации с хитозаном. В этой связи в настоящей работе было изучено влияние живых и инактивированных вирусных вакцин в комбинации с глютаматом хитозана в качестве адъюванта на экспрессию эндосомальных TLRs в дендритных клетках человека. Показано, что инактивированные гриппозные и по-лиомиелитные вакцины незначительно активировали эндосомальные TLRs, за исключением TLR9. Введение хитозана в состав инактивированных вирусных вакцин более заметно повышало численность ДК с экспрессией TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9, что указывало на наличие адъювантных свойств у данного препарата. Живые гриппозные и полиомиелитные вакцины наиболее сильное воздействие оказывали на ДК, экспрессирующие TLR7 и TLR8 (увеличение в 1,67 и 3,14 раз, соответственно, в случае с живой гриппозной вакциной, и в 1,8 и 2,74 раза, соответственно, в случае с живой полиовакциной). Живые гриппозные и полиомиелитные вакцины плохо или незначительно индуцировали численность TLR3- и TLR9- экспрессирующих ДК, однако введение хитозана в живые вирусные вакцины также приводило к повышению количества ДК, экспрессирующих данные рецепторы (увеличение TLR3+ и TLR9+ ДК в 1,58 и 4,0 раза, соответственно в случае с живой гриппозной вакциной, и увеличение TLR3+ и TLR9+ ДК в 1,54 и 2,83 раза, соответственно, в случае с живой полиовакциной). Разная степень активации TLR7 и TLR8 живой гриппозной вакциной в комбинации с хитозаном, возможно, объясняется иммунокорригирующими свойствами хитозана, препятствующими чрезмерной активации иммунокомпетентных клеток. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что одним из возможных механизмов поляризации иммунного ответа по ^-1 типу при иммунизации вирусными вакцинами, содержащими хитозан в качестве адъюванта, может быть повышенная экспрессия эндосомальных TLRs под воздействием вирусных антигенов в комбинации с хитозаном.
Ключевые слова: эндоплазматические TLRs, дендритные клетки, хитозан, гриппозная вакцина, полиовакцина
ВВЕДЕНИЕ
Ключевая роль в осуществлении защиты от патогенов принадлежит врожденным иммунным механизмам, которые обеспечивают быстрое развитие воспалительных реакций, включающих детекцию высококонсерватив-
Адрес: 105064, Москва М. Казенный пер., 5а E-mail: anelly@mail.ru
ных структур, свойственных большой группе микроорганизмов при помощи специальных рецепторов широкой специфичности. Эти рецепторы принадлежат классу сигнальных PRRs, наиболее важными из которых являются толл-подобные рецепторы (toll-like receptors, TLRs) [3, 4].
Широкий спектр лигандов TLRs и представленность этих рецепторов на многих клетках способствует вовлечению TLRs в патогенез многих заболеваний. TLRs индуцируют акти-
вацию и экспрессию специфических генов, контролирующих механизмы иммунологической защиты — от индукции синтеза про-воспалительных цитокинов и интерферонов (обеспечивающих реализацию реакций врожденного иммунитета) до экспрессии костиму-лирующих молекул, способствующих активации Т-лимфоцитов и развитию адаптивного иммунного ответа [5].
Иммунизация инактивированными и живыми вирусными вакцинами, в первую очередь, активизирует врожденный иммунитет, в том числе и систему толл-подобных рецепторов. Антигены живых и вирусных вакцинных препаратов по-разному взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками, затрагивая различные звенья врожденного иммунитета, которые определяют специфику иммунного ответа.
Известно, что некоторые вирусные инак-тивированные вакцины обладают невысокой иммуногенностью и поэтому нуждаются в использовании адъювантов, однако механизмы действия адъювантов остаются малоизвестными, хотя и подчиняются определенным закономерностям. Понимание механизмов действия адъювантов может помочь в повышении эффективности вирусных вакцинных препаратов.
В настоящее время повысился интерес к исследованию возможности регуляции сигнальных путей ТЬИз при помощи иммунотроп-ных средств, которые способны обеспечить определенную степень защиты от различных патогенов [6, 7], а также активаторов и супрессоров ТЬИз и их антагонистов (РРАИу) [8]. Проводятся интенсивные исследования в области генотерапии с целью коррекции генных дефектов ТЬИз, однако взаимодействие путей сигнального каскада требует дальнейшего тщательного изучения [9]. Данный аспект остается одним из наиболее актуальных в области иммунотерапии и вакцинопрофи-лактики для выявления механизмов действия различных иммуномодулирующих и вакцинных препаратов на экспрессию и активацию ТЬИв.
В предыдущих работах нами было показано, что иммунизация инактивированными гриппозными и полиовирусными вакцинами в комбинации с производными хитозана в качестве адъюванта приводит к поляризации иммунного ответа по ТЫ типу [1, 2]. Одним из возможных механизмов такой поляризации
могла быть повышенная активация эндосо-мальных ТЬИз под влиянием вирусных антигенов в комбинации с хитозаном. В этой связи в настоящей работе мы попытались исследовать воздействие живых и инактивированных вирусных вакцин в комбинации с глютаматом хитозана в качестве адъюванта на экспрессию эндосомальных ТЬИв (ТЬИЭ, ТЬИ7, ТЬИ8, ТЬИ9) в дендритных клетках человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Хитозан
В опытах использовали 1%-ый р-р глютама-та хитозана (МВ 300 kD, степень деацетилиро-вания 85%) производства НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. Препарат 1%-ного р-ра хитозана в 0,2М глютаматном буфере (рН 6.2) добавляли в равном объеме к вакцине (конечная концентрация препарата 0,5%). (Патент РФ № 2323742).
Вакцины
В работе были использованы инактивиро-ванные и живые гриппозные и полиомиелит-ные вакцины.
Гриппозные: 1) инактивированная трехвалентная субъединичная очищенная вакцина «Агриппал S1» (фирма Novartis vaccines and diagnostics, Италия) сезона 2010/2011г.г., содержащая следующие штаммы:
A/California/07/2009 NYMC X-181(H1N1), A/Victoria/210/2009 NIMC X-187 (H3N2), В/ Brisbane/60/2008 и 2) холодоадаптированный штамм-донор аттенуации (ХА) А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) (НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, РАМН, Москва, Патент РФ № 2354695).
Полиомиелитная вакцина: 3) инактивированная «Имовакс Полио» (фирма Sanofi-Pasteur, Франция), содержащая вирусы полиомиелита 1, 2, 3 типа. Одна доза вакцины (0,5 мл) содержала 40 ед. D антигена 1 типа, 8 ед. D антигена 2-ого типа и 32 ед. D антигена 3-го типа. 4) живая полиовакцина для перорального применения 1,2,3 типов (производство ФГУ «ПИПВЭ» им. М.П. Чумакова РАМН, Москва).
Получение дендритных клеток (ДК) из мононуклеарныхлейкоцитов
периферической крови (МЛПК) человека 1) Получение моноцитов из МЛПК
Моноциты выделяли из лейкоцитной массы, которую разводили буфером PBS, содержащим Ca2 + и Mg2+ (BioChrom, UK) в соотношении 1:1. Полученную суспензию (35 мл) наслаивали на15 мл фиколла (р = 1,077) (BioChrom). Образцы центрифугировали 30 мин при 650xg. Мононуклеарную фракцию собирали с интерфазы фиколл/сыворотка, переносили в свежие пробирки и два раза отмывали буфером PBS. Во время первого центрифугирования готовили непрерывный градиент на основе перколла (PercollTM GE Healthcare, UK). Градиент перколла получали следующим образом: 30 мл изотонического раствора перколла переносили в 50 мл пробирки и центрифугировали 10 мин при 14000 g и температуре 20 °С с отключенными тормозами. МЛПК ресуспендировали в фосфатном буфере из расчета 108 клеток на 5 мл и наслаивали на полученный градиент. Образцы центрифугировали 30 мин при 400 g и температуре 20 °С. После центрифугирования верхняя клеточная фракция содержала преимущественно моноциты 60 — 80%. Эту фракцию собирали, и 3 раза отмывали буфером PBS.
При необходимости получения популяций клеток, содержащих более 90% моноцитов, обогащенная моноцитами фракция, использовалась для магнитной сортировки CD 14+ клеток при помощи набора для выделения моноцитов (Miltenyi Biotech, USA). Полученная таким образом клеточная популяция содержала 92-95% моноцитов, что контролировалось при помощи анализа поверхностной экспрессии маркера моноцитов CD14 на проточном цитометре FC-500 (Beckman Culter, USA).
2) Получение ДК из моноцитов
Моноциты 5х105, полученные из МЛПК,
ресуспендировали в 1 мл среды RPMI—1640
с Hepes, содержащей 0,32 мг/мл глутамина,
10% термоактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия) и 0,1
мг/мл гентамицина сульфата (Sigma).
Взвесь клеток помещали в культуральные матрасы и добавляли 20 нг/мл рекомбинант-ного гранулоцитарно-макрофагального ко-лониестимулирующего фактора (GM-CSF) и 20 нг/мл интерлейкина-4 (IL-4) (BioSource International Inc, Бельгия) для дифференци-
ровки дендритных клеток. На третьи сутки добавляли те же цитокины. На шестые сутки инкубации производили смену среды с добавлением исследуемых вакцин (по 50 мкл/мл), производных хитозана (1%-ного р-ра глюта-мата хитозана, 50 мкл/мл) или вакцин c раствором хитозана (50 мкл/мл + 50 мкл/мл) для индукции экспрессии TLRs. Через двое суток ДК отмывали от среды культивирования и использовали в экспериментальных целях.
Оценка экспрессии TLRs
Экспрессию TLRs в ДК осуществляли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител против антигенов к TLR3, 7, 8, 9. Клетки отмывали холодным фос-фатно-солевым раствором (ФСБ) с 1%-ной фетальной телячьей сывороткой и инкубировали с пермеабилизирующим буфером (106 клеток/40 м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.