МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, том 41, № 1, с. 71-78
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.152.1
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СТЕРОИД-21-ГИДРОКСИЛАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО МУТАНТНОГО ВАРИАНТА C169R В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ЭКСПРЕССИИ
© 2007 г. Ю. В. Грищук*, П. М. Рубцов, С. Н. Белжеларская
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 05.06.2006 г.
Принята к печати 18.07.2006 г.
Стероид-21-гидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза глюкокортикоидных и минералокорти-коидных гормонов в коре надпочечников - относится к семейству микросомных цитохромов Р450. Дефицит 21-гидроксилазы является наиболее частой причиной адреногенитального синдрома у человека. Впервые в инфицированных рекомбинантными бакуловирусами линиях клеток Sf9 и Hi5 насекомых синтезированы стероид-21-гидроксилаза (CYP21A2) человека и ее мутантный вариант (C169R), обнаруженный ранее у больной с классической формой адреногенитального синдрома. В оптимальных условиях уровень продукции функционально-активной CYP21A2 в клетках насекомых достигает 28% от суммарного микросомного белка. Показано, что мутация C169R не влияет на эффективность синтеза CYP21A2 в клетках насекомых и не препятствует встраиванию фермента в мембраны эндоплазматической сети. Функциональный анализ мутантного фермента in vitro свидетельствует о практически полном отсутствии каталитической активности по отношению к двум субстратам - прогестерону и 17-гидроксипрогестерону.
Ключевые слова: стероид-21-гидроксилаза, адреногенитальный синдром, миссенс-мутация, реком-бинантный бакуловирус, клетки насекомых.
EXPRESSION OF THE HUMAN STEROID 21-HYDROXYLASE GENE AND ITS MUTANT VARIANT C169R IN INSECT CELLS AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF EXPRESSION PRODUCTS, by Yu. V. Gri-schuk*, P. M. Rubtsov, S. N. Beljelarskaya (Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Science, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: Yuliya_grishuk@mail.ru). Steroid 21-hydroxylase is a key enzyme of glucocorticoid and mineralocorticoid biosynthesis in the adrenal gland that belongs to the family of microso-mal cytochrome P450. The steroid 21-hydroxylase deficiency is the most frequent cause of the congenital adrenal hyperplasia. The human steroid 21-hydroxylase (CYP21A) and its mutant variant (C169R) found previously in patient with the classical congenital adrenal hyperplasia were synthesized for the first time in the insect cell lines Sf9 and Hi5 infected by recombinant baculoviruses. Under optimal conditions the level of CYP21A2 production in insect cells achieves 28% of the total microsomal protein. C169R mutation does not effect the synthesis of CYP21A2 in insect cells and does not prevent the incorporation of the enzyme into the membranes of endoplasmic reticulum. Functional analysis of the mutant enzyme in vitro suggested the virtually complete lack of catalytic activity towards two substrates - progesterone and 17-hydroxyprogesterone.
Key words: steroid 21-hydroxylase, congenital adrenal hyperplasia, missense mutation, recombinant baculo-virus, insect cells.
Стероид-21-гидроксилаза (CYP21A2) - один из основных ферментов биосинтеза стероидных гормонов в коре надпочечников - относится к группе микросомных цитохромов Р450. CYP21A2 участвует в биосинтезе глюкокортикоидов и минера-локортикоидов, катализируя превращение 17-ОН-прогестерона (170НР) в 11-дезоксикортизол и прогестерона в дезоксикортикостерон. 21-гидрок-силаза, как и другие цитохромы Р450, это моноок-сигеназа, для каталитической активности которой
* Эл. почта: Yuliya_grishuk@mail.ru
необходим электрон-транспортный партнер. Таким партнером для микросомных цитохромов Р450 служит флавиновая NADPH-цитоxром-P450-оксидоредуктаза [1]. При дефиците CYP21A2 нарушается продукция кортизола и альдостерона, что приводит к развитию разнообразных клинических проявлений. Дефицит CYP21A2 - наиболее частая причина врожденной дисфункции коры надпочечников (90-95% случаев), или адреногенитального синдрома (АгС, ОМ1М 201910). Традиционно выделяют более тяжелые классические формы АГС: сольтеряющую (75%) и прос-
тую вирильную (25%), и легкую неклассическую форму. Частота классических форм недостаточности стероид-21-гидроксилазы составляет в разных популяциях 1 : 15000-1 : 7000 новорожденных, частота неклассической формы в европеоидных популяциях - в среднем 1 : 1000 новорожденных. В геноме человека активный ген CYP21A2 и высокогомологичный ему псевдоген CYP21A1P расположены на расстоянии 30 т.п.н. друг от друга [2]. Де-леции и генные конверсии, обусловленные рекомбинацией между геном и псевдогеном, являются основной причиной повреждений CYP21A2 (95% случаев недостаточности стероид-21-гидроксила-зы). По механизму генной конверсии возникают 10 наиболее частых мутаций гена CYP21A2, общих для всех исследованных популяций. Реже встречаются мутации, не связанные своим происхождением с псевдогеном и характерные для отдельных семей и популяций [3-6]. Выявлено хорошее соответствие между генотипом и фенотипом при дефиците CYP21A2, при этом клинические проявления определяются менее поврежденным аллелем CYP21A2 [5-8]. Мутации гена CYP21A2, вызываемый ими клинический фенотип и данные об остаточной активности фермента приведены в базе данных Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee (информация доступна на сайте http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp21.htm). Для понимания роли той или иной мутации в развитии недостаточности 21-гидроксилазы и тяжести клинических проявлений, пренатальной диагностики и своевременной терапии АГС особенно важными могут оказаться данные по классификации и функциональной характеристике мутаций in vitro с последующим анализом на модели пространственной структуры CYP21, построенной на основе расшифрованных пространственных структур Р450 эукариот [9-12]. Функциональный анализ мутаций CYP21A2 обычно проводят с использованием системы экспрессии в линиях клеток млекопитающих COS-1 [9, 12-15] и COS-7 [10, 11]. Имеются также данные об экспрессии гена CYP21A2 в клетках дрожжей [16, 17] и в клетках млекопитающих с использованием вектора на основе вируса осповакцины [18]. Рекомбинантные цитохромы P450 из разных подсемейств получены также с помощью бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых [19-26]. В культивируемых клетках насекомых можно с высоким выходом синтезировать эукариотические белки, в большинстве случаев прошедшие все стадии посттрансляционной модификации и созревания, что важно для их функционального анализа и кристаллизации [27]. Уникальная мис-сенс-мутация C169R в гене CYP21A2 была найдена при проведении молекулярно-генетического тестирования больных АГС в рамках совместного проекта Эндокринологического научного центра РАМН и Института молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта РАН. Мутацию в гемизи-готном состоянии обнаружили у больной с классической простой вирильной формой недостаточности 21-гидроксилазы. Учитывая аутосомно-рецес-сивный характер наследования и фенотипическое проявление этой мутации, можно было предположить, что у фермента с аминокислотной заменой C169R сохранилась остаточная активность, равная примерно 1-5% активности 21-гидроксилазы дикого типа. Однако данные, полученные с использованием линии клеток COS-7 млекопитающих, свидетельствуют о полной инактивации му-тантного фермента по отношению к двум субстратам CYP21A2 [28]. Для подтверждения этих результатов необходима более эффективная система определения активности 21-гидроксилазы. Решить эту задачу можно с помощью бакуловирусной системы экспрессии, которая позволяет синтезировать большие количества активного белка в клетках насекомых.
Цель настоящей работы состояла в получении функционально-активной стероид-21-гидроксила-зы человека и ее мутантной формы C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирус-ных векторов и в изучении влияния мутации C169R на активность фермента в этой системе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение векторов экспрессии. кДНК гена CYP21Ä2 дикого типа и мутантного варианта CYP21A2-C169R клонировали по сайтам BamHI и Sali в плазмидный бакуловирусный вектор рFast-BacHTb ("Gibco-BRL"), содержащий нуклеотид-ную последовательность, кодирующую гексаги-стидиновый блок, который присоединяется к N-концу рекомбинантного белка. В результате получили рекомбинантные бакуловирусные векторы pFastBacHTb-CYP21A2 и pFastBacHTb-CYP21A2-C169R. Для того чтобы обеспечить встраивание рекомбинантных белков в эндоплаз-матическую сеть клеток насекомых, из плазмид-ной ДНК рFastBacHTa предварительно вырезали фрагмент RsrI-NcoI размером 84 п.н., включающий ATG-кодон, шесть кодонов His и участок узнавания протеазы TEV (рис. 1а). Выступающий 5'-концевой фрагмент, образовавшийся в результате гидролиза ДНК рестриктазой NcoI, достроили фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Escherichia coli. Полученный линеаризованный вектор обработали ДНК-лигазой фага Т4 и трансформировали им штамм DH5a Е. coli согласно [29]. В модифицированном векторе рFastBacHTД по сайтам BamHl и XhoI клонировали кДНК гена CYP21Ä2 дикого типа и мутантного варианта CYP21Ä2-C169R (рис. 16, в) и получили рекомбинантные плазмиды рFastBacHTaД-CYp21А2 и рFastBacHTaД-CYP21A2-C169R. Рекомбинантные бакмиды, содержащие кДНК CYP21Ä2 дикого ти-
Рис. 1. Схема получения рекомбинантных челночных бакуловирусных векторов, содержащих кДНК CYP21A2 и CYP21A2-C169R. а - Получение вектора pFastBacHTaA из вектора pFastBacHTa путем удаления фрагмента RsrII-NcoI, кодирующего гексагистидиновый блок и участок узнавания протеиназы TEV; б, в - клонирование кДНК CYP21A2 и CYP21A2-C169R в векторе pFastBacHTaA по уникальным сайтам рестрикции BamHI и XhoI. Ррh - промотор гена по-лиэдрина; MCS - полилинкер; SV40pA - сайт полиаденилирования вируса SV40; Gent - ген устойчивости к гентамици-ну; Amp - ген устойчивости к ампициллину; pUCori и f1ori - участки начала репликации ColE1 и фага f1; Tn7L и Tn7R -сайты транспозиции, используемые для встраивания рекомбинантных конструкций в геном вируса ядерного полиэд-роза Autographa californica.
па и мут
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.