научная статья по теме ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БЕЛКОВ МЕМБРАНЫ ВКЛЮЧЕНИЯ INCB И INCC. CHLAMYDIA TRACHOMATIS В ESCHERICHIA COLI Химия

Текст научной статьи на тему «ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БЕЛКОВ МЕМБРАНЫ ВКЛЮЧЕНИЯ INCB И INCC. CHLAMYDIA TRACHOMATIS В ESCHERICHIA COLI»

БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 3, с. 333 - 341

УДК 577.212

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БЕЛКОВ МЕМБРАНЫ ВКЛЮЧЕНИЯ IncB и IncC Chlamydia trachomatis в Escherichia coli*

© 2006 г. Е.С. Кострюкова**, В.Н. Лазарев, Г.А. Титова, Т.А. Акопиан, С.А. Левицкий, В.М. Говорун

ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава, 119992 Москва, ул. Малая Пироговская, 1а; факс: (495)246-4501, электронная почта: eles@newmail.ru

Поступила в редакцию 16.08.05 После доработки 23.09.05

Проведено клонирование генов, кодирующих белки мембраны включения IncB и IncC Chlamydia trachomatis в плазмидные векторы серии pET для дальнейшего получения рекомбинантных белков. В результате получены рекомбинантные IncB и IncC C. trachomatis, которые могут быть использованы для последующего антителогенеза и для выявления белков-партнеров в реакциях белок-белкового взаимодействия.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Chlamydia trachomatis, белки мембраны включения, генетический полиморфизм, экспрессия генов.

Chlamydia trachomatis — облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий у человека такие заболевания, как трахома, паховый лимфогранулематоз, урогенитальные хламидиозы. В настоящее время C. trachomatis считается самым распространенным бактериальным агентом, передающимся половым путем [1]. Особенно опасны хламидии для здоровья женщин репродуктивного возраста, так как принимают участие в формировании хронических воспалительных заболеваний малого таза, которые могут приводить к трубной непроходимости, эктопической беременности и бесплодию [2].

Хламидии отлично адаптированы к условиям существования внутри эукариотической клетки благодаря уникальному двухфазному жизненному циклу, который представляет собой последовательную смену метаболических состояний микроорганизма — инфекционного и вегетативного — в виде небольших спороподобных элементарных телец и крупных репродуцирующихся ретикулярных телец соответственно [3]. Хла-мидии характеризуются особым типом взаимоотношений с клеткой-хозяином, называемым энергозависимым абсолютным паразитизмом [4]. Бактерии активно используют АТР и другие

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-186, 20.11.2005.

** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

макроэргические соединения эукариотической клетки, а также конкурируют с ней за питательные вещества, витамины, кофакторы. При этом хламидии подавляют, но сохраняют определенный уровень жизнеспособности хозяина до завершения цикла своего развития. Одним из путей, позволяющим хламидиям «ускользать» от контроля эукариотической клетки, является их способность ингибировать процессы апоптоза

[5, 6].

Внутриклеточный этап развития хламидий происходит внутри особой мембранной вакуоли, называемой включением. Предполагается, что взаимодействие хламидий с клеткой-хозяином может осуществляться с помощью собственных уникальных белков, располагающихся в мембране включений, называемых Inc-белками (inclusion proteins) [7]. Inc-Белки обнаружены практически у всех видов хламидий, причем их гомологи отсутствуют у каких-либо других известных организмов. Данные белки отличаются один от другого первичными аминокислотными последовательностями, однако для всех Inc-белков характерно наличие двудольного гидрофобного домена, состоящего из 50—80 аминокислот, который, возможно, и определяет их локализацию в мембране включения [8]. Кроме того, в геномах хламидий обнаружено значительное число открытых рамок считывания, кодирующих белки со сходным гидрофобным профилем, причем подобные гены пол-

ностью отсутствуют во всех остальных известных сегодня геномах [9]. В настоящее время выяснены некоторые биологические свойства только двух из них — IncA принимает участие в образовании единственного включения при множественной хламидийной инфекции [10], IncG взаимодействует с эукариотическим белком 14-3-3Р [11]. Функции остальных Inc-бел-ков до сих пор неизвестны. Однако тот факт, что их гидрофильные домены располагаются на ци-топлазматической поверхности мембраны включения и фосфорилируются киназами клетки-хозяина, а экспрессия генов, кодирующих некоторые Inc-белки, начинается в течение первого получаса после заражения культуры клеток, позволяет предположить, что они могут играть роль медиаторов во взаимодействии хлами-дий с эукариотической клеткой [7].

Наибольший интерес представляют данные о связи Inc-белков C. trachomatis с белками и ор-ганеллами инфицированной клетки. Отсутствие систем генетической трансформации хламидий значительно затрудняет изучение структуры и функций белков мембраны включения. При этом экспрессия их генов в гетерологичных системах осложняется нерастворимостью Inc-бел-ков в цитоплазме и их токсичностью для клетки-хозяина. Поэтому до сих пор для антителоге-неза [12, 13] и изучения возможной взаимосвязи Inc-белков с системой III типа секреции [14] использовались рекомбинантные гидрофильные домены данных протеинов. Получение же полноразмерных рекомбинантных Inc-белков может оказаться одним из путей к обнаружению их партнеров и приблизить исследователей к пониманию патогенеза хламидийной инфекции.

В качестве объекта исследования нами были выбраны два представителя семейства белков мембраны включения — IncB и IncC. Гомологи данных белков известны также и у других представителей данного семейства — C. pneumoniae [15], C. psittaci [12], C. muridarum [16], C. abortus [17]. Гены incB и incC располагаются в области начала репликации генома как у C. trachomatis, так и у C. pneumoniae [8]. Это характерно для белков, принимающих участие в самых важных метаболических процессах клетки, таких как репликация, транскрипция, трансляция. IncB и IncC относятся к белкам ранней фазы инфекции, экспрессия их генов начинается в течение первого получаса после заражения клетки-хозяина [18, 19] и совпадает по времени с такими важными процессами, как формирование включения, его транспортировка в перинуклеарное пространство и избежание слияния с ранними лизосомами [7]. Подобные характеристики позволили нам предположить, что IncB и IncC мо-

гут играть существенную роль на ранних этапах развития хламидийной инфекции и оказаться необходимым звеном в процессах формирования включения.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.

В работе были использованы штаммы Es^richia coli DH5a («Life Technologies», Великобритания), B834 (DE3) и BL21 TrxB (DE3) [pLysS] («Novagen», США). Референс-штамм C. trachomatis D/UW-3/Cx (ATCC VR-885) был любезно предоставлен доктором E. Hjelm (Уппсальс-кий университет, Швеция). Клинические изоля-ты C. trachomatis были выделены из соскобов слизистой цервикального канала пациенток Института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (Санкт-Петербург, Россия) в 1998, 1999 гг.

В процедурах клонирования и экспрессии использовались плазмидные векторы pGEM-Т/easy («Promega», США), pET-15b и pET-32a(+) («Novagen»).

Определение генетического полиморфизма генов incB и incC. Гены incB и incC амплифициро-вали методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров в программируемом термостате Thermal Cycler Abbott LCX Probe System (Великобритания) с помощью Pfu-полимеразы («MBI Fermentas», Литва) согласно инструкции производителя.

Нуклеотидную последовательность генов incB и incC определяли с использованием набора для термоциклического секвенирования Big DyeTM Terminator v. 3.0 Cycle Sequencing («Applied Biosystem», США). Реакцию проводили в объеме (20 мкл), содержавшем 10 нг плаз-мидной или геномной ДНК, 3,2 пМ специфического праймера и реакционную смесь (Terminator Ready Reaction Mix), предоставленную производителем.

Продукты реакции анализировали с использованием автоматического секвенатора ABI Prism Genetic Analyzer 3100 («Applied Biosystem», «Hitachi», Япония).

Для сравнения нуклеотидных последовательностей генов incB и incC использовали программу Vector NTI (InforMax Inc, США).

Клонирование полноразмерных генов incB и incC. Полноразмерные гены incB и incC ампли-фицировали с использованием специфических праймеров (таблица), как указано выше. Продукты амплификации очищали с помощью набора Wizard PCR Preps DNA Purification System («Promega») и клонировали в плазмиду pGEM-T/easy («Promega») согласно инструкции произ-

водителя. Далее гены Inc-белков субклонирова-ли в плазмидные векторы pET-15b и pET-32a согласно стандартным протоколам [20] с использованием эндонуклеаз рестрикции (таблица) и Т4 ДНК-лигазы («MBI Fermentas»).

Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК. Получение компетентных клеток лабораторных штаммов E. coli DH5a, B834 (DE3) и BL21 TrxB (DE3) [pLysS] и трансформацию ре-комбинантной плазмидной ДНК проводили методом Hanahan [21]. Отбор рекомбинантных клонов осуществляли методом скрининга с использованием изопропил^^-тиогалактозида и X-gal и методами контрселекции на средах с антибиотиками (ампициллин (50 мкг/мл) либо ампициллин (50 мкг/мл), хлорамфеникол (34 мкг/мл) и канамицин (15 мкг/мл) для штаммов В834 и BL21 TrxB (DE3) [pLysS] соответственно).

Индукция экспрессии генов incB и incC в клетках E. coli. Культуру клеток E.coli B834 (DE3) либо BL21 (DE3) [pLysS] TrxB трансформировали плазмидными конструкциями pET-15b/IncB, pET-15b/IncC, pET-32а/IncB либо pET-32аД^С (рис. 1). Несколькими рекомбинант-ными колониями инокулировали 100 мл среды TB (1,2% бактотриптона, 2,4% дрожжевого экстракта, 4% глицерина, 17 мМ KH2PO4, 72 мМ К2НРО4), содержавшей ампициллин (50 мкг/мл) либо ампициллин (50 мкг/мл), хлорамфеникол (34 мкг/мл) и канамицин (15 мкг/мл) для штаммов B834 [pLysS] и BL21 TrxB (DE3) [pLysS] соответственно, и растили при 37° и постоянном встряхивании до достижения культурой оптического поглощения OD600 = 1,2. Экспрессию гена целевого белка индуцировали добавлением изопропил^^-тиогалактозида до конечной концентрации 0,1 мМ. Культуру инкубировали в

течение ночи при 30° и постоянном встряхивании, центрифугировали при 6000 g 30 мин, осадки замораживали при —75°. Наличие целевого белка проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в 12—15%-ном ПААГ согласно стандартной метод

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком