ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 6, с. 842-844
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 611.018.81
ЭКСПРЕССИЯ ХОЛИНАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ В МОТОНЕЙРОНАХ СПИННОГО МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ АНТИОРТОСТАТИЧЕСКОГО ВЫВЕШИВАНИЯ
© 2007 г. Р. Р. Исламов, О. В. Тяпкина, Э. А. Бухараева, Л. О. Ягодина, Н. Н. Ибрагимова, В. В. Валиуллин, член-корреспондент РАН И. Б. Козловская, член-корреспондент РАН Е. Е. Никольский
Поступило 19.01.2007 г.
На Земле скелетно-мышечная система приспособлена к действию гравитационных сил. Опорная нагрузка является одним из главных факторов, обеспечивающих нормальное функционирование двигательной системы. Устранение опорной нагрузки в условиях невесомости или в эксперименте на Земле приводит к развитию ги-погравитационного двигательного синдрома, для которого характерны мышечная слабость, атония, арефлексия, атрофия мышечных волокон [1]. Подобные морфофункциональные изменения в скелетной мышце возникают при нарушении нейротрофического контроля, который реализуется: 1) при помощи нейрогенных трофических веществ, секретируемых из нервной терминали в синаптическую щель, и 2) частотой импульсации мотонейронов, сопровождающейся секрецией нейро-медиатора [3].
Мотонейроны спинного мозга принадлежат к популяции холинэргических нервных клеток. Синтез АХ происходит в нервной терминали из холина и ацетил-КоА при помощи фермента хо-линацетилтрансферазы (ХАТ). Снижение экспрессии ХАТ в мотонейронах спинного мозга показано при нейродегенеративных заболеваниях (например, боковой амиотрофический склероз, хорея Хантингтона), одним из патогномоничных признаков которых является прогрессирующая мышечная слабость [6, 10]. Мутация гена CHAT, кодирующего ХАТ, обусловливает развитие ми-астенического синдрома, также характеризующегося внезапными эпизодическими кризами мышечной слабости [7]. Вместе с тем известно, что
Казанский государственный медицинский университет
Институт биохимии и биофизики
Казанского научного центра
Российской Академии наук, Казань
ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем
Российской Академии наук, Москва
при опорной разгрузке, например в невесомости, уже в первые дни обнаруживается снижение мышечной силы, что свойственно при развитии гипо-гравитационного двигательного синдрома. Механизмы развития этого синдрома на сегодняшний день остаются мало изученными [4]. В настоящем исследовании нами была экспериментально проверена гипотеза о роли ХАТ в развитии гипогравита-ционного двигательного синдрома в условиях микрогравитации на модели антиортостатического вывешивания лабораторных крыс [9].
Половозрелых крыс-самцов линии Вистар массой 260-280 г подвешивали за хвост в специальной клетке. Через 35 сут животных наркотизировали. Для изучения экспрессии ХАТ в мотонейронах, иннервирующих мышцы задних конечностей, у подопытных и контрольных крыс выделяли поясничный отдел спинного мозга, который процес-сировали для иммуногистохимического исследования и иммуноблоттинга.
Иммуногистохимическое исследование. На поперечных срезах поясничного отдела спинного мозга толщиной 20 мкм выявляли ХАТ иммуно-пероксидазным методом [5]. Антитела (АТ) к хАт (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) применяли в разведении 1:500. Для иммунной реакции с первичными АТ был применен стрептави-дин-биотиновый комплекс (Elite ABC Kit; Vector Laboratories). Иммунопреципитат визуализировали при помощи диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase; Vector Laboratories). Иммуногистохимическое исследование сегментов спинного мозга на уровне L4-L5 выявило холинэргические нейроны в передних рогах спинного мозга как у контрольных (n = 3), так и у подопытных (n = 3) крыс. Осадок иммуногистохимической реакции локализовался в перикарионе и отростках двигательных нейронов. Сравнительный анализ иммуногистохимической реакции обнаружил дифференциальное окрашивание мотонейронов спинного мозга у интактных и подопытных животных. При одинаковых условиях иммуногистохимиче-
ЭКСПРЕССИЯ ХОЛИНАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ
843
(а)
»Pi
' "V
;> ^. V»
ílí^.л]
» • -.,< Л - -■■* - ■
1 ■ .. щ -
is;
■Г
яви
шщг.....
у IÍ -»к .s ■ •• .„-i, .
■х : • . >•': - ;
,ч, у . ч, . ■ ,
.** ж
(б)
31
'• ás
'.J
Рис. 1. Иммуногистохимическая реакция с АТ к ХАТ на поперечных срезах поясничного отдела ^4-Ь5) спинного мозга интактной крысы (а) и животного после 35 сут антиортостатического вывешивания (б). Специфический иммуно-преципитат локализуется в перикарионах и отростках мотонейронов в передних рогах спинного мозга.
скои реакции плотность иммунопреципитата с AT к ХАТ в мотонеИронах спинного мозга контрольных животных была существенно выше, чем у подопытных крыс через 35 суток антиортостатического вывешивания (рис. 1).
Иммуноблоттинг. ДенатурированныИ белко-выИ экстракт, полученныИ из поясничного отдела спинного мозга, разделяли с помощью электрофореза и переносили на PVDF-мембрану (Immo-bilon P, "Millipore"). Мембраны инкубировали с AT к ХАТ (Chemicon) в разведении 1:1000. Первичные AT выявляли стрептавидин-биотиновым методом (Elite ABC Kit; Vector Laboratories). Им-мунопреципитат визуализировали с помощью ди-аминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase; Vector Laboratories). Окрашенные мембраны сканировали, денситометрическиИ анализ полученных изображении проводили в программе Scion Image. Интенсивность иммунноИ реакции нормализовали по сигналу в-актина, которыИ дополнительно выявляли после отмывания мембран от первоИ иммуноферментноИ реакции. AT против в-актина ("Sigma") применяли в разведении 1:200. Отношение сигнала белка-мишени интактноИ ткани к в-актину было принято за 100%. На основании контрольных значениИ высчитывали процентные изменения количества белка в опытных образцах. КоличественныИ анализ экспрессии XAT обнаружил существенное различие в содержании XAT в белковом экстракте из спинного мозга контрольных и подопытных крыс после 35 сут антиортостатического вывешивания. У подопытных животных было зарегистрировано снижение уровня XAT на 54% по сравнению со значениями у контрольных крыс (рис. 2).
Модель опорноИ разгрузки задних конечно-стеИ Morey-Holton широко применяется для имитации гипогравитации на Земле в лабораторных условиях. При этом морфофункциональные изменения в скелетных мышцах напоминают тако-
XAT
в-актин
Инт
Опыт
% 100
60 -
20 -
Инт
Опыт
Рис. 2. Иммуноблоттинг (верхняя панель) и денсито-метрический анализ (нижняя панель) интенсивности экспрессии ХАТ по отношению к Р-актину. Приведены средние значения трех независимых иммунобло-тов. Инт - поясничный отдел спинного мозга интакт-ного животного, Опыт - поясничный отдел спинного мозга подопытных животных после 35 сут вывешивания. По оси Y - содержание ХАТ, значения интактно-го спинного мозга приняты за 100%.
ÑOKHAÑbl AКAДEМИИ HAyK том 414 < 6 2007
844
ИСЛАМОВ и др.
вые, возникающие при гипогравитационном двигательном синдроме в невесомости. При опорной разгрузке задних конечностей, как и в условиях невесомости, за короткий срок развивается атрофия скелетных мышц (снижение мышечной массы, уменьшение диаметра МВ), развивается мышечная атония, уменьшается сила сокращения и повышается утомляемость мышц, изменяется экспрессия сократительных белков и белков цитос-келета [4]. Поэтому модель Могеу-Но^оп может быть применена в изучении патогенеза гипограви-тационного двигательного синдрома, развивающегося в условиях невесомости. На основании литературных данных, свидетельствующих, что снижение активности и (или) экспрессии ХАТ в мотонейронах играет важную роль в развитии миастенического синдрома, в настоящем исследовании нами была изучена роль ХАТ в патогенезе гипогравитацион-ного двигательного синдрома. Иммуногистохими-чески и методом иммуноблоттинга нами обнаружено существенное снижение экспрессии ХАТ в мотонейронах спинного мозга после 35 сут анти-ортостатического вывешивания крыс.
В наших предварительных исследованиях установлено, что опорная разгрузка задних конечностей крыс в течение 35 дней по Могеу-Но1-Шп приводит к значительному снижению сырой массы как т. soleus, так и т. EDL (на 50 и 30% соответственно), а мембранный потенциал покоя МВ снижается на 10 мВ в обеих мышцах. Морфо-функциональные характеристики скелетной мышцы, такие, как мышечная масса, экспрессия мышеч-но-специфических белков, МПП и др., находятся под нейротрофическим контролем, который реализуется с помощью нейрогенных молекул (ней-регулинов) [8] и за счет импульсной активности мотонейронов [2]. Учитывая тот факт, что секреция АХ играет главную роль в реализации нейро-трофического контроля через электрическую импульсацию, можно предположить, что снижение экспрессии ХАТ отражается на синтезе АХ и, как следствие, приводит к нарушению нейротро-фического контроля и развитию характерных для гипогравитационного двигательного синдрома изменений со стороны скелетной мышцы. При этом следует подчеркнуть, что внутриаксонный синтез белка и аксонный транспорт также могут
влиять на характер активности ХАТ в нервной терминали мотонейрона при гипогравитацион-ной разгрузке.
Считается, что трансляция мРНК ХАТ происходит в перикарионе, откуда далее фермент в составе быстрого аксонного транспорта доставляется в нервную терминаль. Поэтому снижение экспрессии ХАТ в мотонейронах спинного мозга, а также возможные нарушения аксонного транспорта и внутриаксонного синтеза белка могут играть важную роль в механизме развития гипогравитационного двигательного синдрома.
Исследование поддержано грантами: ФЦНТП № 02.442.11.7319, РФФИ 06-04-49396, Президента РФ НШ-4444.2006.4 "Фундаментальные науки -медицине", Программой фундаментальных исследований Отделения биологических наук РАН "Фундаментальные механизмы регуляции внутренней среды и организации поведения живых систем", Программой "Организация и финансирование работ молодых ученых Российской Академии наук по приоритетным направлениям фундаментальных исследований".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С. // Рос. физиол. журн. 2004. Т. 90. № 5. С. 508-521.
2. Резвяков Н.П, Никольский Е.Е. // Физиол. журн. СССР. 1978. Т. 64. № 8. С. 1117-1123.
3. Улумбеков Э.Г.,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.