ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 5, с. 448-455
= БИОХИМИЯ =
УДК 618.11-006.6-033.2:577.156
ЭКСПРЕССИЯ И АКТИВНОСТЬ ПРОТЕАЗ ПРИ МЕТАСТАЗИРОВАНИИ
РАКА ЯИЧНИКОВ
© 2014 г. Н. В. Юнусова, Л. В. Спирина, И. В. Кондакова, Л. А. Коломиец,
А. Б. Виллерт, О. В. Шпилева
Научно-исследовательский институт онкологии СО РАМН, 634009 Томск, пер. Кооперативный, 5 E-mail: BochkarevaNV@oncology.tomsk.ru Поступила в редакцию 18.10.2013 г.
Исследованы тотальная химотрипсиноподобная активность протеасом, активность пулов 20S- и 268-протеасом, активность кальпаинов, а также экспрессия металлопротеиназы PAPP-A в ткани первичной опухоли и ткани метастазов у 13 больных эпителиальным раком яичников. Показано, что инициация процесса распространения опухолей происходит на фоне активных протеолитиче-ских процессов. Выявлены снижение активности 268-протеасом и тотальной активности кальпаинов, а также повышение экспрессии металлопротеиназы PAPP-A в первичных опухолях у больных с наличием асцита по сравнению с таковыми у больных без асцита. Обнаружено прогрессирование заболевания после проведенного лечения и достигнутой стабилизации у больных со сниженной активностью внутриклеточных протеаз и высоким содержанием PAPP-A в первичной опухоли.
DOI: 10.7868/S0002332914050142
Известно, что внутриклеточные и внеклеточные протеазы играют большую роль в развитии злокачественных новообразований ввиду их способности регулировать содержание биологически важных молекул, участвующих в пролиферации, апоптозе, дифференцировке клеток. Один из наиболее значимых этапов многих физиологических и патологических процессов — внутриклеточная деградация белков в протеасомах. Убикви-тин-протеасомная система принимает участие в разрушении многих регуляторных белков, в том числе молекул путей передачи сигналов от ростовых факторов и частично самих рецепторов ростовых факторов, а также многих онкосупрессор-ных белков (Emmerich et al., 2000). Основной компонент убиквитин-протеасомной системы — протеасомы (мультисубъединичные комплексы, включающие в себя каталитическое ядро 20S, к которому присоединены одна или две регулятор-ные частицы). Если по крайней мере одной из этих частиц является РА700 (1^-регуляторная частица), то образуется 26S-протеасома, осуществляющая главным образом аденозинтрифос-фат (АТФ)- и убиквитинзависимый протеолиз большинства клеточных белков. Если же в роли регуляторной частицы выступает другой белок (РА28, РА200), то такая ассоциация представляет собой 20S-протеасому и деградирует малые, аномальные и короткоживущие белки (Almond, Cohen, 2002). Относительное содержание протеасом в клетке, их состав и активность изменяются в соответствии с потребностями клетки и условиями,
в которых она находится. Это становится возможным благодаря взаимодействию протеасом с большим количеством белков, а также благодаря механизмам регуляции на уровне транскрипции, которые на данный момент остаются малоизученными (Sharova, Zakharova, 2008; Сорокин и др., 2009).
Кальцийзависимая кальпаиновая система деградации представляет внутриклеточное семейство нелизосомальных цистеиновых протеаз. Кальпаин-1 и -2, а также их ингибитор кальпаста-тин достаточно изучены и экспрессируются в большинстве злокачественных новообразований (Salehin et al., 2011; Storr еt al., 2012). Кальпаины могут стимулировать рост опухолевых клеток, участвуя в деградации некоторых онкосупрессор-ных белков, таких как р53, NF2, 1кВа, p107 (Woo et al., 2012). В то же время они способны разрушать некоторые онкогенные продукты, например тромбоцитарный фактор роста, рецептор эпидер-мального фактора роста. Кальпаинзависимое разрушение характерно для протеинкиназы С и сопровождается ингибированием опухолевой прогрессии (Hiwasa et al., 2002).
К числу протеаз, действующих в основном экстраклеточно, относится металлопротеиназа PAPP-A (КФ 3.4.24.79), входящая в подсемейство паппализинов. Этот фермент гидролизует инсу-линоподобные факторы роста (IGFBPs), главным образом IGFBP-4, а также IGFBP-5 и IGFBP-2 (Юнусова и др., 2013). Таким образом, PAPP-A участвует в регуляции содержания активных ин-
сулиноподобных факторов роста. Других субстратов протеазной активности PAPP-A не выявлено, но есть данные, что PAPP-A обладает собственной ангиогенной активностью (или индуцирует экспрессию основного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF)) (Jadlowiec et al., 2006). Это также может быть важным моментом вовлеченности ме-таллопротеиназы PAPP-A в механизмы опухолевой прогрессии. Хорошо изучена роль экстраклеточных протеаз, главным образом металлопротеаз межклеточного матрикса в метастазировании злокачественных новообразований (Кондакова и др., 2008). Однако участие внутриклеточных протеаз и внеклеточной протеазы PAPP-A в процессе мета-стазирования исследовано недостаточно. В связи с этим комплексное исследование активности каль-паинов, протеасом и металлопротеиназы PA-P-A достаточно актуально для изучения молекулярных механизмов метастазирования опухолей.
Предполагается существование взаимного влияния протеаз в клетке, которое опосредовано наличием общих функций. Основное значение в деградации белков отводится протеасомам. Каль-паины способствуют изменению структуры белков, что делает их восприимчивыми к дальнейшему расщеплению протеасомами. Экспериментально обнаружено, что активация кальпаинов приводит к увеличению активности протеасом и усилению деградации протеинов в клетках диафрагмы крыс (Smith, Dodd, 2007). На клеточных линиях фибробластов человека было показано, что интерлейкин-1в-стимулированная продукция как мРНК PAPP-A, так и самого белка, а также повышение протеазной активности PAPP-A обусловлены активацией ядерного транскрипционного фактора NF-kB, которая в свою очередь регулируется протеасомной системой деградации (Resch et al., 2006). Однако взаимодействие про-теолитических систем в злокачественных новообразованиях при их метастазировании изучено недостаточно.
Исследование на модели рака яичников обусловлено тем, что для данной локализации характерны все возможные способы метастазиро-вания — имплантационный, лимфогенный и гематогенный. При эпителиальных вариантах опухолей по частоте метастатического поражения брюшина и большой сальник стоят на первом месте.
Цель работы — изучение активности протеасом и кальпаинов, активности пулов 20S- и 26S-проте-асом, экспрессии металлопротеиназы PAPP-A и взаимосвязей между протеазами в первичной опухоли (ПО) и метастазах (Mts) в сальник.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании использованы полученные при выполнении оперативного вмешательства (диагностическая лапароскопия или циторедук-тивная операция) образцы опухолевой ткани 13 больных с морфологически верифицированным раком яичников эпителиального происхождения III стадии в соответствии с международной классификацией FIGO (2009). Исследование было одобрено этическим комитетом НИИ онкологии СО РАМН. Средний возраст больных составил 50.8 ± 2.5 года. У всех больных были низко-дифференцированные серозные карциномы яичников с метастазами в большой сальник. Было проведено хирургическое лечение всех больных с последующей полихимиотерапией. Наличие или отсутствие асцита, а также его объем на диагностическом этапе определяли по результатам лапароцентеза, а также по данным ультразвукового исследования и магнитно-резонансной томографии. Данные о прогрессировании рака яичника после проведенного комплексного лечения (развитие местного рецидива или отдаленных метастазов) были получены из амбулаторных карт. Образцы ткани опухоли и метастазов рака в большой сальник для определения экспрессии и активности протеаз забирали на этапе хирургического вмешательства, аликвотировали, замораживали и хранили при —80°С.
Получение осветленных гомогенатов. Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ Tris-HCl-буфера (pH 7.5), содержащего 2 мМ аденозинтрифосфата, 5 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола, 1 мМ этилендиамин-тетрауксусной кислоты и 100 мМ хлорида натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10000 g и 4°С.
Фракционирование протеасом. Все процедуры проводили при 4°С. Белки осветленных гомоге-натов фракционировали с помощью сульфата аммония в два этапа. Фракцию, обогащенную 268-протеасомами, получали добавлением сульфата аммония до 40% насыщения, фракцию 208-протеасом — добавлением сульфата аммония до 70% насыщения (Абрамова и др., 2004). В полученных фракциях определяли активность протеасом.
Определение активности протеасом. Химот-рипсиноподобную активность тотального пула протеасом, активность пулов 26S- и 20S- протеасом определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей, а также во фракция протеасом по гидролизу флуорогенного оли-гопептида N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4- Methylcoumarin (N-SLLVT-7-A-4-M) (Sigma, США), утилизирующегося химотрипсиноподоб-ными центрами протеасом (Ben-Shahar etal.,
160 120 80 40
У 200
св
100
6 -
4 -
ПО
Mts0
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
Рис. 1. Тотальная активность протеасом (а), активность кальпаинов (б) и экспрессия металлопротеиназы PAPP-A (в) в опухоли (ПО) и метастазах рака в сальник (Mts) у больных раком яичников (медианные значения). Линии — показатели активности и экспрессии протеаз у каждой больной. 1—13 — больные раком яичника; для рис. 1 и 2.
страта использовали тот же флуорогенный оли-гопептид N-SLLVT-7-A-4-M, который был использован для определения активности протеасом. Такая модификация метода Санд-манна была предложена Коли (Kohli et al., 1997). Реакционная смесь содержала 100 мМ Tris-HCl (pH 7.3), 145 мМ NaCl. Реакцию проводили, добавляя к 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, растворенному в реакционной смеси, 5 мкл супернатанта и инкубируя при 25°C в течение 30 мин в присутствии или в отсутствие 10 мМ CaCl2 и 0.4 мкМ ингибитора ^ацетил^еи^еи-норлейцинала (Sigma). N-аце-тил^еи^еи-норлейцинал ингибирует как каль-паины (константа ингибирования — K = 190 (220) нМ), так и протеасомы (K = 6000 нМ). Учитывая такую существенную разницу в значениях K, можно считать, что этот ингибитор в высоких концен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.