БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 472-479
УДК 577.3
ЭКСПРЕССИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ БЕЛКА ORAI-1 В СКЕЛЕТНЫХ МИОБЛАСТАХ И МИОТУБУЛАХ
© 2008 г. П. В. Авдонин12, К. В. Сурков1, И. Ф. Суханова1, У. Т. Руегг3
1Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова 26; факс: 499-135-8012;
электронная почта pvavdonin@yandex.ru
2 Институт общей патологии и патофизиологии РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская 8
3 University of Geneva, Geneva, Switzerland Поступила в редакцию 26.05.2008 г.
Установлено, что в культивируемых линиях C2C12 и mdx edl скелетных миобластов и миотубул мыши экспрессируется канальный белок Orai-1. Роль белка Orai-1 в транспорте ионов Ca2+ в этих клетках изучали с использованием малых интерферирующих РНК (миРНК), направленных против мРНК Orai-1. Подобраны условия эффективной трансфекции миРНК в миобласты и миотубулы. В экспериментах на миотубулах mdx edl показано, что инактивация мРНК, кодирующей Orai-1, приводит к полному подавлению входа 45Ca2+, вызванному ингибитором кальциевой АТР-азы эндо-плазматического ретикулума тапсигаргином. Полученные данные свидетельствуют об участии канального белка плазматической мембраны Orai-1 в депо-зависимом входе ионов Ca2+ в скелетные миотубулы.
Исследование процессов внутриклеточного обмена ионов кальция - это одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений физиологии клетки. Благодаря созданию флуоресцентных зондов для измерения концентрации ионов кальция в цитоплазме и в клеточных органеллах, усовершенствованию электрофизиологических методов и успехам молекулярной генетики достигнут существенный прогресс в этой области. Выявлено многообразие и сложность механизмов регуляции транспортирующих Ca2+ ионных каналов [1, 2]. Количество обнаруженных в плазматической мембране кальциевых каналов превысило несколько десятков. В большинстве клеток экспрессируется несколько видов каналов, способных транспортировать ионы кальция из внешней среды в цитоплазму. Поскольку ионы кальция выполняют функцию вторичного посредника во всех типах клеток, был поставлен вопрос, какие из кальциевых каналов ответственны за обеспечение именно этой универсальной функции кальция. Среди катион-ных каналов, проницаемых для ионов кальция, особый интерес вызывали каналы семейства TRP (transient receptor potential). Значительная часть из них выполняет узкоспециализированные функции по рецепции вкусовых раздражителей, температуры, по транспорту ионов кальция и магния в эпителиальных клетках кишечника и почек и т.д. Однако в это большое семейство входит группа из семи каналов, обозначаемых TRPC (добавлена буква С - от слова canonical), которые распространены практически повсеместно, и как считалось, участвуют в реализации универсального механизма ак-
тивации входа кальция в клетки рецепторами, сопряженными с фосфолипазой С и фосфоинозитид-ным обменом [3]. Картина усложнилась в 2006 г., когда был открыт представитель нового семейства кальциевых каналов - белок Orai-1 [4], который формирует кальций-транспортируюшую пору в каналах, сопряженных с внутриклеточным депо кальция (CRAC - calcium release activated calcium channels) [4]. В семейство Orai входят четыре вида канальных белков: Orai-1, две изоформы белка Orai-2 и Orai-3 [5]. Канальные белки Orai сопряжены с Ca2+-связываюшим белком мембраны эндо-плазматического ретикулума STIM1. После высвобождения Ca2+ из ретикулума STIM1 кластеризуется в той части мембраны ретикулума, которая обрашена к плазматической мембране и вызывает активацию канала Orai [6]. Рассматриваются два возможных механизма сопряжения STIM1 с каналом Orai - прямое физическое взаимодействие или передача сигнала через растворимый посредник. В последнем случае предполагается, что при опустошении кальциевых депо STIM1 активирует фос-фолипазу А2, которая запускает реакцию или каскад реакций, приводяших к образованию посредника липидной природы, активируюшего каналы Orai [7].
Долгое время считалось, что в клетках скелетной мускулатуры реализуются принципиально иные механизмы транспорта этого катиона - вход Ca2+ снаружи происходит через потенциалуправля-емые кальциевые каналы L-типа, а высвобождение Ca2+ из ретикулума осушествляется через риа-
нодин-чувствительные каналы. Сокращение скелетных мышц под действием ацетилхолина происходит вследствие деполяризации, вызванной входом ионов натрия через лиганд-активируемые каналы, представляющие собой никотиновые хо-линорецепторы. Деполяризация приводит к активации механизма электромеханического сопряжения, выбросу Ca2+ из ретикулума и к активации входа Ca2+ через каналы L-типа [8]. В последние годы выяснилось, что наряду с этим классическим механизмом в мышечных клетках работают механизмы кальциевого обмена, присущие электроневозбудимым клеткам. На препарате изолированных мышечных волокон мыши [9] и на дифференцированных в миотубулы клетках С2С12 [10] продемонстрирован депо-зависимый вход Ca2+, который по своим характеристикам не отличается от депо-зависимого входа Ca2+ в электроневозбудимые клетки. В дифференцированных миотубулах С2С12 и в культуре миотубул, выделенных из скелетных мышц, выявлены Р2У-пуринорецепторы, сопряженные с фосфоинозитидным обменом и входом Ca2+, а также Р2Х-пуринорецепторы [11, 12]. Эти рецепторы регулируют процесс диффе-ренцировки миобластов в миотубулы [13]. Помимо пуринергических рецепторов в клетках С2С12 вход ионов кальция активируют мембранные рецепторы сфингозин-1-фосфата [14, 15]. Действие сфингозин-1-фосфата опосредовано G-белок-за-висимыми рецепторами EDG3 и EDG5, сопряженными с фосфолипазой С [16] и фосфолипазой D [17] соответственно. Оказалось, что увеличение [Ca2+]^ в миофибриллах под влиянием ацетилхолина, действующего через никотиновые рецепторы, также связано с активацией фосфоинозитидно-го обмена [18]. Таким образом, вход и мобилизация внутриклеточного кальция в клетках скелетной мускулатуры осуществляется не только по классическим механизмам, характерным для электровозбудимых клеток, но и через другие системы обмена кальция.
Целью настоящей работы было выяснение возможности участия белка Orai-1 в транспорте ионов кальция в клетках скелетной мускулатуры. Нами показано, что в культивируемых скелетных миоб-ластах и миотубулах линии C2C12 и в линии скелетных миобластов mdx edl экспрессируется Orai-1. Для того чтобы исследовать его функциональную роль, подобраны условия трансфекции скелетных миобластов и миотубул малыми интерферирующими РНК - миРНК (small interfering RNA - siRNA). Синтезированы миРНК, инактивирующие мРНК белка Orai-1. С использованием этого подхода получены данные, свидетельствующие об участии Orai-1 в депо-зависимом входе ионов кальция в скелетные миотубулы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования выполнены на линии клеток С2С12 (скелетные миобласты мышцы задней конечности мыши) [19] и на дифференцированных в миотубулы клетках mdx edl, выделенных из скелетной мышцы extensor digitorum longus (EDL) мыши линии mdx, дефицитной по белку дистрофину [18]. Клетки С2С12 выращивали в СО2-инкубато-ре (5% СО2) при 37°С в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с высокой концентрацией глюкозы ("HyClone", США), 10% эмбриональной сыворотки теленка ("HyClone") и L-глутамином (150 мг на 450 мл среды, "HyClone"). При достижении клеточным слоем плотности 60-70% клетки пассировали, используя растворы трипсина и Версена в соотношении 3 : 7 ("Биолот", Россия). Для инициации и поддержания процесса образования длинных многоядерных миотубул (путем слияния отдельных миобластов) среду культивирования с 10% эмбриональной сывороткой теленка заменяли на такую же среду, содержащую 2% лошадиную сыворотку. Среду заменяли при плотности клеточного слоя около 60%. Клетки инкубировали в диффе-ренцировочной среде в течение 4-7 сут. Клетки mdx edl культивировали в условиях, описанных ранее [18].
В экспериментах по определению входа 45Ca2+ использовали дифференцированные многоядерные миотубулы mdx edl 22-го пассажа. Для определения входа 45Ca2+ миотубулы, выращенные в 24-лу-ночном планшете, отмывали от среды культивирования физиологическим солевым раствором (physiological salt solution - PSS), содержащим (мМ): NaCl 145, KCl 5, HEPES 5 (рН 7.4), MgCl2 1 и глюкозу 10. Затем инкубировали в PSS в течение 15 мин при 37°С и меняли раствор на PSS с 1.2 мМ CaCl2 и 1 мкКи 45CaCl2. После инкубации в течение 10 мин отмывали холодным раствором PSS без кальция с 1 мМ EGTA и измеряли количество поглощенного клетками 45Ca2+. Таким образом определяли базальный уровень входящего в клетки 45Ca2+. Депо-зависимый вход ионов кальция в миотубулы стимулировали с помощью преинкубации в бескальциевой среде PSS и инкубации в среде PSS с 1.2 мМ CaCl2 и 45Ca2+ в присутствии 2 мкМ тапсигаргина. Эксперименты проводили на нетранс-фицированных миотубулах mdx edl, рассматриваемых в качестве контроля, и миотубулах, трансфи-цированных миРНК. Приведены средние значения, вычисленные по результатам четырех-шести параллельных измерений.
Нуклеотидные последовательности миРНК подбирали с помощью онлайн-сервиса фирмы "Dharma-con" (www.dharmacon.com). Были подобраны четыре миРНК, определяющие расщепление в клетке мРНК белка кальциевого канала Orai-1, комплементарные следующим участкам кодирующей области мРНК Orai-1: миРНК1 - 5'UUGCUCACAGCCUC-
Соотношение содержания мРНК, кодирующей Orai-1, и мРНК фактора элонгации eF1A и глицеральдегид-фос-фат-дегидрогеназы (ГАДФГ)
Клетки Orai-1/eF1A Orai-1/ГАФДГ ГАФДГ/eF^
Миобласты С2С12 0.0027 0.0048 0.565
Миобласты mdx edl 0.00515 0.00216 2.38
Миотубулы mdx edl 0.00491 0.00107 4.59
GAUGU; миРНК2 - 5 'UGUCCCGCUUGCCUCU-UGA; миРНК3 - 5'ACUUCCACCAUCGCUACCA; миРНК4 - 5'AACUCGGCCAGCUCAUUGA. миРНК синтезировали ферментативным путем с использованием набора Silencer siRNA Construction Kit ("Ambion"). Положительным контролем служила миРНК из этого набора, направленная на расщепление мРНК глицеральдегид-фосфат-дегидроге-назы (ГАФДГ).
Миобласты трансфицировали с помощью реагентов Lipofectaminetm2000 ("Invitrogen"), Meta-fectinetmPRO ("Biontex"), DreamFecttm ("OZ Biosciences") и jetPE
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.