научная статья по теме ЭКСПРЕССИЯ КДНК ГЕНА СЕРОТОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА МЫШИ (5НТ1С) В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ Биология

Текст научной статьи на тему «ЭКСПРЕССИЯ КДНК ГЕНА СЕРОТОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА МЫШИ (5НТ1С) В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 477-482

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.122

ЭКСПРЕССИЯ кДНК ГЕНА СЕРОТОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА МЫШИ (5НТ1с) В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ

© 2004 г. С. Н. Белжеларская*, Ф. Саттон1

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991

1South Dakota State University, South Dakota, 57007, USA Поступила в редакцию 21.03.2003 г. Поступила после доработки 18.07.2003 г.

Метод клонирования и экспрессии кДНК гена серотонинового рецептора мыши в клетках насекомых с использованием бакуловирусов предложен как альтернативный методу, в котором применяют систему с ооцитами, обычно используемую для электрофизиологических исследований функции ионных каналов. С помощью сконструированной рекомбинантной бакмидной ДНК ген рецептора серотонина 5НТ1с мыши переносили в геном вируса AcNPV с образованием рекомбинантного ба-куловируса, что обеспечивало получение зараженных клеток насекомых Sf9, продуцирующих ре-комбинантный серотониновый рецептор 5НТ1с.

Ключевые слова: серотонин, рецептор, ионные каналы, бакуловирусы, клетки насекомых, E. coli, ооциты, экспрессия генов, рекомбинантные белки.

В настоящее время для сверхпродукции реком-бинантных белков в эукариотических клетках наиболее часто используется бакуловирусная экс-прессирующая система на основе клеток насекомых отряда Spodoptera. Эта система позволяет экспрессировать многие рекомбинантные гены, продукты которых или остаются внутри клеток, или ассоциированы с поверхностью клеток, или секретируются в культуральную жидкость [1]. Поскольку уровень экспрессии генов в этой системе высок, есть возможность использовать ее для электрофизиологических исследований в клетке, в частности, при изучении функционирования ионных каналов в процессе передачи стрес-сорного сигнала. В данной работе для получения рекомбинантных бакуловирусов использовали 7и7-связанную транспозицию в E. coli по методу Лакоу и соавт. [2] в модификации Леуша и соавт. [3]. Этот метод получения рекомбинантного вируса более прост, поскольку при создании и отборе рекомбинантной бакмиды, содержащей геном бакуловируса, применяли простые в обращении бактериальные клетки. В настоящей работе мы предлагаем использовать процедуру клонирования и экспрессии гена серотонинового рецептора мыши в клетках насекомых на основе бакуловирусов как альтернативную процедуре, использующей ооциты для электрофизиологического исследования функционирования ионных каналов и

Принятые сокращения: 5НТ1с - серотониновый рецептор

мыши, 5НТ - серотонин, tns-A-E - гены транспозиции,

AcNPV - бакуловирус.

*Эл. почта: belj@eimb.ru

связанных с ними рецепторов. Предполагается использовать предложенную процедуру для исследования серотонинового рецептора и ионных каналов, экспрессирующихся на поверхности клеточной мембраны, в системе передачи стрес-сорного сигнала.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе использовали бактериальные штаммы Е. соИ БН5а и БН10Вас ("аЪео-ВКЬ" США).

Трансформацию клеток плазмидными ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя.

Выделение и очистку ДНК плазмид, расщепление рестриктазами, лигирование, электрофорез ДНК в агарозном геле проводили по стандартным протоколам [4]. При клонировании гена рецептора 5НТ1с мыши использовали плазмидную ДНК рЕа81ВасНТЪ ("аЪсо-ВКЬ" США). В качестве источника гена рецептора серотонина использовали плазмиду рвЕМ921, содержащую кДНК серотонинового рецептора 5НТ1с (р5НТ1с-Т7) [5].

Рекомбинантные бакмиды получали и анализировали как описано в инструкции [6]. Рекомби-нантную бакмидную ДНК вводили в клетки насекомых в присутствии реагента СеПЕЕСТШ [6].

При культивировании клеток насекомых использовали основные технические приемы, разработанные Саммерсом и Смитом [7]. Клетки Б/9 растили в монослое в среде 81-900 II БЕМ ("вШсо-ВИЬ" США), при 28°С. Суспензионную культуру выращивали во флаконах (25 и 75 см2) в той

RsrII

5'- промотор полиэдрина- CTCGGTCCGAAACC ATG TCG ТАС ТАС CAT С АС

met ser tyr tyr his his

CAT CAC CAT CAC GAT TAC GAT АТС CCA ACG ACC GAA AAC CTG

his his his his asp tyr asp ile pro thr thr glu asn leu 6 x histidine affinity tag spacer region rTEV

Ehel Ncol BamHI EcoRI StuI

TAT TTT С AG GGC GCC ATG GGA TCC GGA ATT С AA AGGCCT ACG

tyr phe gin gly ala met gly ser gly ile gly arg pro thr protease cleavage site

Sail__SstI__SpeI NotI NspV__Xbal _

TCG ACG AGC TCA СТА GTC GCG GCC GCT TTC GAA TCT AGA GCC

ser thr ser ser leu val ala ala ala phe glu ser arg ala PstI__XhoI SphI KpnI__HindIII

TGC AGT CTC GAG GCA TGC GGT ACC AAG CTT GTC GAG AAG TAC

cys ser leu glu ala cys gly thr lys leu val glu lys tyr TAG AGG АТС AT А АТС AG - 3'

stop

Рис. 1. Полилинкерная последовательность pFastBacHTb [6].

же среде с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Через 72 ч после трансфекции собирали культуральную среду, содержащую рекомбинантный бакуловирус. Определение вирусного титра, амплификацию вируса, заражение клеток 8/9 рекомбинантным бакуловирусом, а также анализ вирусной экспрес-

Бакмидная ДНК

-23130

-9416 -6557

Рис. 2. Электрофоретическая подвижность высокомолекулярной рекомбинантной бакмидной ДНК рВасНТ-5НТ1с (продукта клонирования геномной ДНК 5НТ1с мыши в бакуловирусном векторе рБаБ^ ВасНТ) в 0.5%-ном агарозном геле. 1 - Плазмидная ДНК-помощник; 2 и 3 - рекомбинантная бакмидная ДНК; 4 - ШМЛ/Яш<Ш1 фрагменты.

сии проводили, как описано теми же авторами [7]. Инфицированные клетки Sf9 использовали для выделения суммарной клеточной ДНК и реком-бинантного несекретируемого белка. ДНК анализировали по электрофоретической подвижности с помощью электрофореза в 0.5%-ном агарозном геле в присутствии стандарта молекулярной массы и методом ПЦР в присутствии праймеров pUC/M13.

ПЦР (35 циклов - 94°С, 45 с, 55°С, 45 с, 72°С, 5 мин, после предварительной денатурации 93 °С 3 мин) проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего по 50 пмоль каждого праймера -M13/pUC18 (прямого) и M13/pUC18 (обратного), 0.2 ммоль каждого dNTP, 10 нг бакмидной ДНК, 2.5 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы.

Дот-гибридизацию ДНК рекомбинантов проводили по Саммерсу и Смиту [7].

Для электрофоретического разделения белков

в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия использовали метод Лэммли [8]. Рекомбинантный белок выделяли из клеточного лизата с помощью аффинной хроматографии на колонках со смолой Ni-NTA [9.10].

Радиоактивную метку вводили с помощью набора "Prime-a Gene Labeling System" ("Promega")

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Процедура получения белкового продукта -рецептора серотонина - включала три основных этапа: клонирование фрагмента ДНК, содержа-

Not I

pFastBacHT

Бакмидная ДНК ^

attB

прямой праимер

обратный праймер

II.

2430300-

12 3

12 3 4

4740-

300

Рис. 3. I. Область переноса геномной последовательности рецептора 5НТ1с, заключенной между элементами Tn7L и Tn7R транспозона Tn7, из полученной рекомбинантной ДНК pFastBacHT^HT^ в бакмиду по сайту Tn7 mini-att с помощью сайт-специфической транспозиции [6]. II. Электрофоретическая подвижность ПЦР-продуктов рекомбинантной бакмиды в 0.7%-ном агарозном геле. а - 1 - ПЦР-продукт (2430 п.н.) для бакмиды с дополнительной последовательностью из донорной плазмиды pFastBacHT; 2 - ПЦР-продукт размером 300 п.н. для бакмиды; 3 - маркеры для длин фрагментов. б - 1 и 2 - фрагменты 4740 п.н. для бакмиды с дополнительной последовательностью из рекомбинантной плазмиды pFastBacHT^HTl^ содержащей фрагмент кДНК гена рецептора серотонина размером 2310 п.н.; 3 - продукт 300 п.н. для бакмиды; 4 - маркеры длин фрагментов (DNA lkb Ladder).

а

щего последовательность кДНК гена серотони-нового рецептора 5НТ1с мыши в плазмидном ба-куловирусном векторе рЕа$1ВасНТь, получение рекомбинантной бакмидной ДНК, которая должна обеспечить перенос гена рецептора серотонина 5НТ1с мыши в геном АсКРУ, и получение ре-комбинантного бакуловируса, продуцирующего рекомбинантный рецептор серотонина 5НТ1с в зараженных клетках насекомых 5/9. Опишем последовательно эти этапы.

1. При конструировании рекомбинантной векторной ДНК рЕа$1ВасНТ-5НТ1с использовали

плазмидный бакуловирусный вектор pFastBacHTb ("Monsanto"), содержащий полилинкерную после-довательнсть, бакуловирусный полиэдриновый промотор, элементы Tn7L и Tn7R транспозона Tn7 и последовательность 6xHis, место расщепления протеазы TEV (рис. 1). Плазмиду pFast-BacHTb расщепляли рестриктазами Sali и Noti, фракционировали и выделяли из легкоплавкой агарозы фрагмент ДНК длиной 4836 п.н. Фрагмент ДНК длиной 2310 п.н. из плазмиды p5HTlc-T7, расщепленной рестриктазами Sali и Noti, содержит кДНК гена серотонинового рецептора 5НТ1с. Его выделяли из легкоплавкой агарозы и

4 3 2 1

п.н.

4740

-23130

-9416 - 6557

10 11 12

- I

- II

- III

- IV

Рис. 4. Анализ ДНК клеток насекомых 8©, инфицированных рекомбинантным вирусом ЯБЫТ-5ЫТ1с. а - 1, 2, 3 - эле-ктрофоретическая подвижность суммарной клеточной ДНК в 0.5%-ном агарозном геле; 4 - ХП^А/ИтЛИ фрагменты. б - ПЦР-анализ ДНК рекомбинантных клеток насекомых. Приведена электрофоретическая подвижность ПЦР-про-дуктов в 0.7%-ном агарозном геле. 1 - ПЦР-продукт вирусной ДНК дикого типа; 2, 3 - ПЦР-продукт 4740 п.н. вирусной ДНК, содержащей последовательность из рекомбинантной плазмиды рБа81БасЫТ-5НТ1с; 4 - маркеры длин фрагментов. в - Гибридизационный анализ суммарной рекомбинантной клеточной ДНК с комплементарным [32Р]ДНК-зон-дом для 5НТ1с. I - 8, 9 - суммарная ДНК из клеток насекомых, инфицированных вирусом дикого типа Ас№У, I - 10, 11 - суммарная ДНК из клеток насекомых.

соединяли с векторным фрагментом с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Продукты лигирования вводили в клетки E. coli, штамм DH5a, и отбирали клоны с рекомбинантными плазмидами на средах, содержащих ампициллин. Размер клонированной последовательности в составе нового вектора определяли с помощью рестрикционного анализа. Конструкция полученной рекомбинантной плазмиды рРа$1ВасНТ-5НТ1с такова, что целевой ген под контролем бакуловирусного поли-эдринового промотора располагается между элементами Tn7L и Tn7R транспозона Tn7.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»