БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 2, с. 253-256
== ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 577.21,579.873.21:579.258
ЭКСПРЕССИЯ МАЛЫХ РНК MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS В МЫШИНЫХ МОДЕЛЯХ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
© 2014 г. Д. В. Игнатов*, О. Ю. Тимошина*, Н. Н. Логунова**, Т. А. Скворцов*, Т. Л. Ажикина*' #
*Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, Москва, Яузская аллея, 2 Поступила в редакцию 15.10.2013 г. Принята к печати 25.10.2013 г.
Перспективным методом разработки новых способов воздействия на патогенные бактерии является выявление механизмов, способствующих их выживанию в инфицированном организме, и возможностей их блокирования. Среди этих механизмов выделяется регуляция метаболизма бактерий при помощи малых РНК, важная роль которой в патогенезе ряда бактерий была выявлена в последнее время. Нами проведено исследование уровня экспрессии трех наиболее высоко экспрессирую-щихся малых РНК Mycobacterium tuberculosis MTS0997, MTS1338 и MTS2823 в динамике развития туберкулеза в линиях мышей с различной генетической устойчивостью к туберкулезу и показано, что максимальный уровень экспрессии этих малых РНК наблюдается на ранних стадиях инфекции.
Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, малые РНК, экспрессия in vivo.
DOI: 10.7868/S0132342314020055
За последнее десятилетие в бактериях найдено множество малых регуляторных транскриптов, а также определены некоторые процессы, в которых они принимают участие. Установлено, например, что большинство малых РНК, закодированных в межгенных участках, синтезируются в ответ на воздействие внешних факторов. Это помогает бактериям адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, например, патогенным бактериям — к организму хозяина. Также известно, что некоторые некодирующие РНК контролируют экспрессию генов, кодирующих факторы вирулентности в ряде бактерий [1].
Малые некодирующие РНК обнаружены у многих видов бактерий, в том числе и у Mycobacte-rum tuberculosis [2, 3]. По данным массированного секвенирования транскриптома M. tuberculosis малые некодирующие РНК составляют 58% от фракции суммарной РНК, очищенной от рРНК.
Целью данной работы было исследование динамики экспрессии малых РНК M. tuberculosis при развитии инфекции in vivo. Нами было выбрано 3 малых РНК, MTS0997, MTS1338, MTS2823, для которых ранее показано повышение уровня экс-
Сокращения: КОЕ — колониеобразующая единица; ОТ-ПЦР — ПЦР с обратной транскрипцией. # Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-65-47; факс: +7 (495) 330-65-38; эл. почта: tatazhik@ibch.ru).
прессии в легких инфицированных мышей на поздних сроках развития хронического туберкулеза (9 месяцев после заражения) [4]. Мы хотели определить, влияют ли стадия заболевания и генетические особенности организма хозяина на уровень экспрессии этих малых РНК. Для этих целей нами были использованы модели туберкулезной инфекции в линиях мышей с различной генетической устойчивостью к туберкулезу [5].
Аэрогенное заражение малыми дозами бактерий M. tuberculosis приводит к хронической, но вполне контролируемой инфекции у резистентных животных линии B6 и к фатальной легочной патологии у чувствительных животных I/St. Мыши I/St погибают от прогрессирующего туберкулеза через 120—150 дней после заражения, а мыши В6 выживают в течение 8—10 месяцев. Различия в количестве микобактерий в легких между мышами I/St и В6 достигают двух порядков в течение первого месяца после заражения, а затем эта разница сохраняется на протяжении всего цикла наблюдений [5]. Для определения изменения экспрессии малых РНК при развитии болезни были выбраны следующие временные точки: 2 недели после заражения (число КОЕ одинаково в обеих линиях; иммунный ответ еще не развился, поэтому возможные различия в бактериальном тран-скриптоме минимальны); 6 недель после заражения (существенное различие в числе КОЕ, бакте-
254
ИГНАТОВ и др.
т
чо
о Я л ч
в
и
о о
в
о «
и
о о <0
р
с
о
м m
100
10-
10-
10-
10-
10-
MTS2823
MTS1338
MTS0997
J CN4D CN4D Й
II I I К
4D4D ^
pqpq^
PQ
mm
l_J CN4D CN4D Й
II I I К
fifi
^ PQPQ^ MM PQ
J CN4D CN4D Й
II I I К
4D 4D ^
PQPQvo PQ
mm
РНК L I/St-2 I/St-6 B6-2 B6-6 B6-7m
MTS2328 (7.70 ± 3.01) х 10-2 (1.99 ± 0.13) х 10-1 (2.22 ± 0.03) х 10-1 (4.58 ± 0.44) х 10-1 (1.41 ± 0.03) х 10-1 (2.54 ± 0.14) х 10-2
MTS1338 (2.26 ± 0.07) х 10-4 (1.05 ± 0.14) х 10-1 (2.08 ± 0.05) х 10-1 (1.72 ± 0.19) х 10-1 (5.84 ± 0.12) х 10-2 (5.55 ± 0.24) х 10-3
MTS0997 (5.75 ± 0.09) х 10-5 (1.69 ± 0.32) х 10-3 (6.28 ± 0.39) х 10-4 (1.78 ± 0.08) х 10-3 (7.76 ± 0.05) х 10-4 (1.83 ± 0.10) х 10-4
Уровень экспрессии малых РНК MTS0997, MTS1338 и MTS2823 в мышиных моделях туберкулезной инфекции B6 (резистентная линия) и I/St (чувствительная линия) на разных сроках после заражения и в логарифмической фазе роста культуры клеток M. tuberculosis (L). Цифры в названии образцов суммарной РНК соответствуют срокам после заражения мышей: "2" — 2 недели; "6" — 6 недель; "7m" — 7 месяцев. Ось ординат приведена в логарифмической шкале. В таблице под диаграммой приведены усредненные данные трех независимых экспериментов и стандартная ошибка среднего.
риальный транскриптом отражает механизмы адаптации бактерии к генетическим особенностям хозяина); 7 месяцев после заражения (выживают только мыши линии В6, стадия хронической инфекции). Для каждой из этих временных точек были получены образцы суммарной РНК: "I/St-2", "B6-2", "I/St-6", "B6-6", "B6-7m", в качестве контроля использовали тотальную РНК из культуры клеток M. tuberculosis в логарифмической фазе роста ("L") (рисунок).
Для выделения РНК легкие мышей гомогенизировали в реагенте Trisol (Invitrogen) и дальнейшие процедуры осуществляли по стандартному протоколу с использованием фенола и хлороформа. Построение первых цепей кДНК на матрице РНК было проведено с помощью набора реактивов Mint (Евроген, Россия) и рассеянной затрав-
ки. Уровень экспрессии малых РНК определяли методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Последовательности использованных олигонуклеотидных праймеров приведены в таблице.
Уровень экспрессии малых РНК МТ80997, МТ81338 и МТ82823, определенный относительно 168 рРНК в различных временных точках при инфекции в мышах с разной устойчивостью к туберкулезу, а также в логарифмической фазе роста культуры, приведен на рисунке. Высокий уровень экспрессии всех трех малых РНК наблюдается уже через 2 недели после заражения мышей. Число транскриптов МТ82823 в инфицированных легких мышей обеих линий превышает таковое в культуре клеток приблизительно на порядок величины. Число транскриптов МТ80997 в услови-
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 40 № 2 2014
ЭКСПРЕССИЯ МАЛЫХ РНК MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 255
Олигонуклеотидные праймеры, использованные для ОТ-ПЦР в реальном времени
Название Последовательность (5' ^ 3')
qPCR_MTS1338_for GGGGAAACCCGGTGATCTG
qPCR_MTS1338_rev GGTAGGTCAAACCGGGTGTACAT
qPCR_MTS2823_for AAGCCCGGTGAGGCCAA
qPCR_MTS2823_rev CGTCGATGCCATCTGCTGTT
qPCR_MTS0997_for GAAGCAGGCCCGGTTAGTGA
qPCR_MTS0997_rev GGCAGACCCGGCGTGACT
16S_for TACGTAGGGTGCGAGCGTTG
16S_rev CCCGCACGCTCACAGTTAAG
ях in vivo выше, чем в культуре клеток, более чем в 100 раз. Самое большое различие между уровнями экспрессии в условиях in vitro и in vivo наблюдается для малой РНК MTS1338. Количество транскриптов различается на три порядка величины. Такие изменения в уровне экспрессии могут свидетельствовать о том, что MTS1338 и MTS0997 в гораздо большей степени важны для персистирования микобактерий в макрофагах, чем MTS2823. На это может также указывать тот факт, что уровень экспрессии MTS1338 и MTS0997 при хронической инфекции (7 месяцев после заражения) остается выше уровня экспрессии этих РНК в культуре, а уровень экспрессии MTS2823 при хронической инфекции падает ниже уровня экспрессии в культуре.
MTS2823 представляет собой достаточно длинный (~300 нт.) транскрипт, считываемый с участка плюс-цепи ДНК между генами Rv3661 и Rv3662c. Было показано, что повышенная экспрессия MTS2823 приводит к существенным изменениям в экспрессии компонентов метил-цитратного цикла [4], который является одним из важнейших источников углерода для клеточного роста [6]. Механизмы регуляции с участием MTS2823 пока не известны, но стабильно высокий уровень экспрессии этой РНК в разных условиях in vitro и in vivo может указывать на ее структурную роль.
В то же время, по данным публикации [4] малая РНК MTS1338 практически не синтезируется в логарифмической фазе роста, но накапливается на достаточно высоком уровне в стационарной фазе. Экспрессия MTS1338 контролируется фактором DosR, влияющим на приспособление бактерий к анаэробной среде, в том числе во время латентной инфекции. Это может объяснять резкое повышение уровня ее экспрессии in vivo, а также то, что даже в хроническом состоянии уровень ее экспрессии выше, чем в культуре.
Другим интересным фактом является падение уровня экспресии всех трех РНК при развитии инфекции в мышах линии В6, устойчивой к туберкулезу, в точках 2 и 6 недель, а также 7 месяцев. Характер падения сходен для всех трех РНК, что может быть следствием уменьшения общего количества транскриптов в хронической стадии [7, 8].
Мы ожидали увидеть различия в экспрессии малых РНК в инфицированных организмах с разной устойчивостью к туберкулезу, поскольку уже к 6-й неделе после заражения у них формируется различный иммунный ответ [5], однако оказалось, что эти различия невелики. В целом, можно отметить, что характер иммунного ответа хозяина не является основным фактором, определяющим экспрессию этих малых РНК, но подтверждение этого требует дополнительных исследований.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Министерства образования и науки РФ (соглашение № 8308); РФФИ (№ 12-04-00173, 1104-01325, 13-04-40072-Н); Программой поддержки ведущих научных школ России (проект НШ-1674.2012.4); Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Toledo-Arana A.,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.