ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 4, с. 414-421
= РЕГЕНЕРАЦИЯ
УДК 576.7
ЭКСПРЕССИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ ГЕНОВ Pax6, Otx2, Six3, FGF2 В ХОДЕ РЕГЕНЕРАЦИИ СЕТЧАТКИ ТРИТОНА
© 2008 г. П. П. Авдонин, Ю. В. Маркитантова, Р. Д. Зиновьева,
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: yulma98@rambler.ru Поступила в редакцию 21.10.2007 г.
Работа посвящена изучению молекулярно-генетических механизмов регенерации сетчатки у взрослых тритонов Pleurodeles waltl. Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии регуляторных генов Pax6, Otx2, Six3 и генов сигнальных молекул FGF2 в нативном пигментном эпителии и сетчатке и на последовательных стадиях регенерации сетчатки. Для оценки типов дифференцировки клеток использованы гены-маркеры дифференцировки клеток пигментного эпителия RPE65 и сетчатки: ßII-tubulin, Rho. На стадии формирования мультипотентных нейробластов регенерирующей сетчатки выявлена активация экспрессии нейроспецифических генов Pax6, Six3 и гена ростового фактора FGF2 и снижение уровня экспрессии регуляторного гена Otx2 и гена RPE65. Экспрессия генов Pax6, Six3, Fgf2 сохраняется и на более поздней стадии регенерации сетчатки, на которой также выявляются маркеры дифференцировки клеток сетчатки - ßII-tubulin (ßII-тубулин) и Rho (родопсин). Предполагается многофункциональность исследуемых регуляторных генов, заключающаяся в контроле не только трансдифференцировки клеток пигментного эпителия (ключевая стадия регенерации сетчатки), но и дифференцировки клеток регенерирующей сетчатки. Впервые полученные в данной работе результаты, свидетельствующие о коэкспрессии генов Pax6, Six3, Fgf2, ßII-tubulin, Rho, являются косвенным подтверждением возможного взаимодействия регуляторных и специфических генов в ходе регенерации сетчатки.
В. И. Миташов
Регенерация сетчатки из клеток пигментного эпителия у взрослых тритонов - уникальная модель трансдифференцировки клеток. Дифференцированные клетки пигментного эпителия являются основным источником клеток, обеспечивающих регенерацию сетчатки. В восстановлении сетчатки принимают участие также клетки цили-арно-терминальной ростовой области сетчатки. Клетки пигментного эпителия после удаления сетчатки дедиффереренцируются, активно про-лиферируют и образуют популяцию клеток-предшественников, мультипотентных нейробластов. В ходе регенерации сетчатки мультипотент-ные нейробласты продуцируют семь основных типов клеток, формирующих в конечном итоге полноценную сетчатку (Миташов, 1976). Молеку-лярно-генетические механизмы трансдифференцировки клеток, лежащей в основе всех последовательных этапов регенерации сетчатки, изучены недостаточно.
Основная задача исследований молекулярных механизмов регенерации сетчатки состоит в идентификации генов, активация которых запускает цепь событий, приводящих к ее восстановлению. Последовательность процессов дифференцировки клеток при регенерации сетчатки аналогична таковым, происходящим в ходе ее развития в онтогенезе (Stroeva, Mitashov, 1983;
Klein et al., 1990). Поэтому наиболее эффективным путем решения этой задачи является сравнительный анализ экспрессии генов, контролирующих последовательные стадии развития и регенерации. Дифференцировка клеток пигментного эпителия и сетчатки в ходе нормального развития глаза находится под контролем сети индуктивных сигналов и регуляторных генов, между которыми могут происходить как прямые, так и нелинейные взаимодействия. Сигнальные молекулы, связываясь со специфическими рецепторами, запускают внутриклеточный каскад молекулярных взаимодействий, вызывающий индукцию, либо подавление экспрессии того или иного регуляторного гена. Ре-гуляторные факторы образуют определенные транскрипционные комплексы, инициирующие и регулирующие экспрессию подконтрольных им специфических генов-мишеней. Экспериментальные данные последних лет указывают на то, что для нормального развития сетчатки и пигментного эпителия критическими являются взаимодействия между транскрипционными факторами, кодируемыми гомеобокссодержащими генами Pax6, Otx2, Six3, Rx, Chx и bHLH-доменным геном Mitf (Mathers, Jamrich, 2000; Zhang L. et al., 2000; Zhang S. et al., 2002; Baumer et al., 2003; Martinez-Morales et al., 2003; Zuber et al., 2003; Hors-
ford et al., 2005; Zaghloul et al., 2007). В качестве основных сигнальных путей координации экспрессии этих регуляторных генов, рассматриваются сигнальные пути FGF2, TGFP, SHH, WNT, BMP (Guillemot, Cepko, 1992; Vogel-Hopker et al., 2000; Zhao et al., 2001; Martinez-Morales et al., 2004; Spence et al., 2007).
В настоящее время в ряде зарубежных лабораторий занимаются изучением экспрессии регуляторных генов при регенерации, в частности на модели регенерации сетчатки тритона (Kaneko et al., 2001; Tsonis, Del Rio-Tsonis, 2004; Sakami et al., 2005; Chiba et al., 2006; Susaki, Chiba, 2007; Spence et al., 2007).
Цель работы состояла в сравнительном исследовании особенностей экспрессии группы регуляторных генов Pax6, Otx2, Six3, гена сигнальных молекул FGF2, генов-маркеров дифференциров-ки RPE65, PII-tubulm, Rho в нативных клетках пигментного эпителия и сетчатки, а также на последовательных стадиях ее регенерации у взрослых тритонов. Впервые предпринята попытка выявить отличия между нативными и депигментиро-ванными клетками пигментного эпителия на уровне экспрессии генов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на взрослых тритонах Pleurodeles waltl, разводимых в аквариальной ИБР РАН. Животных наркотизировали в 2%-ном растворе уретана, приготовленном на 0.65%-ном NaCl и хирургическим путем удаляли хрусталик и сетчатку через разрез в дорсальной области глаза. Затем отрезали радужку с роговицей и отделяли ножницами пигментный эпителий с сосудистой оболочкой от склеры. На стадии 20 сут после удаления сетчатки, анализировали суммарный образец зачатка сетчатки, пигментного эпителия и сосудистой оболочки. На стадии 50 сут после операции вышеописанным методом получали образцы тканей зачатка сетчатки и пигментного эпителия с сосудистой оболочкой. В нативных глазах анализировали сетчатку и пигментный эпителий,изолированный вместе с сосудистой оболочкой. Полученные образцы тканей в течение 2-3 сут хранились при -20°C в растворе Ever Fresh (Клоноген, Россия), стабилизирующем РНК.
Для морфологической характеристики стадий регенерации сетчатки, глаза на 20-е и 50-е сут после удаления хрусталика и сетчатки, а также на-тивные глаза фиксировали в растворе Буэна, отмывали в 70%-ном спирте, обезвоживали по стандартной методике и заключали в парафин. Полученные серийные поперечные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином-эозином.
Выделение тотальной РНК из полученных образцов осуществляли с помощью набора TRI Reagent (Sigma, США). Выделение мРНК из тотальной РНК проводили с помощью набора реактивов (Силекс М, Россия) по протоколу производителя. На матрице мРНК синтезировали первую цепь кДНК с помощью обратной тран-скриптазы, гексануклеотидов (Силекс М), следуя прилагаемому протоколу.
Для количественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК были предварительно отнормированы по гену, кодирующему фермент общего метаболизма клеток, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (ГАФДГ) тритона. Библиотеки кДНК считаются отнорми-рованными при одинаковом уровне экспрессии ГАФДГ. При использовании праймеров: прямого 5'-CGGAATCAACGGATTTGG-3' и обратного 5'-TACTGAGATGGGTACCTGCG-3' размер полученного в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента составляет 148 н. п. Праймеры для ПЦР-анализа экспрессии исследуемых генов конструировали на основании данных о структуре этих генов из базы данных Национального Центра Биотехнологической информации (NCBI, США), с использованием компьютерной программы DNAStar. Полимеразную цепную реакцию проводили на матрице кДНК на амплифика-торе EPPENDORF MasterCycler (Германия) с помощью набора (Силекс М), согласно прилагаемому протоколу. Условия реакции зависели от размера, нуклеотидного состава синтезируемого ПЦР-фрагмента и уровня экспрессии гена. Оценка уровня экспрессии исследуемых генов проводилась на анализаторе гелей (UVP LTD, Англия) по интенсивности свечения окрашенных бромистым этидием полос, полученных при электрофо-ретическом разделении ПЦР-продуктов в 1%-ном агарозном геле.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Впервые методом ПЦР проведен комплексный анализ изменения экспрессии генов-регуляторов развития тканей глаза (FGF2, Pax6, Otx2, Six3) и специфических генов-маркеров диффе-ренцировки (RPE65, ßII-tubulin, Rho) при регенерации сетчатки тритона из клеток пигментного эпителия. Нами охарактеризованы ранний и поздний этапы регенерации сетчатки. Нуклео-тидные последовательности праймеров для ПЦР анализа исследуемых генов и размеры полученных ПЦР-фрагментов приведены в таблице.
Экспрессия генов FGF2, Pax6, Six3, Otx2 в нативных пигментном эпителии и сетчатке. В пигментном эпителии и сосудистой оболочке выявлен высокий уровень экспрессии гена Otx2, контролирующего дифференцировку клеток пигментного эпителия, а также гена RPE65, маркера
Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для ПЦР-анализа
Ген Структура праймера Размер фрагмента, н. п.
ГАФДГ Пр. 5'-CGGAATCAACGGATTTGG-3' Обр. 5'-TACTGAGATGGGTACCTGCG-3' 148
FGF2 Пр. 5'-GACCCAAGAGGCTGTACTGCA-3' Обр. 5'-GTTGTTGGACTCCAGTCGCTC-3' 252
Pax6 Пр. 5'-AAGATTCTGGGCAGGTATTA-3' Обр. 5'-TCCTCCCTTCTCCACTTTGC-3' 644
Otx2 Пр. 5'-GAAGCAACCACCTTACACC -3' Обр. 5'-CTAGGTGGTGGTGTGAACTGC-3' 393
Six3 Пр. 5'-TTCCAC(A/C)(G/C)CGGCAACTTCCG-3' Обр. 5'- CCGGTTCTTAAACCAGTTGC-3' 354
RPE65 Пр. 5'-CTGACGGGGGAATACCTCAAC-3' Обр. 5'-CTGTGGAAACTCAAAGGCTAGGC-3' 400
рП-ШЬыин Пр. 5'-GTGCGGTAACCAAATTGGAGC-3' Обр. 5'-TCGGTCTGGGTACTCTTCCC-3' 453
Rho Пр. 5'- CTACATGTTCTTGTTGATTCTGC-3' Обр. 5'-TAGATGGAAGAACTCTTGGC-3' 685
Примечание. Пр. - прямой праймер; Обр. - обратный праймер.
дифференцированных клеток пигментного эпителия. Ген ростового фактора FGF2 экспрессиру-ется в пигментном эпителии на низком уровне (рис. 1а). В то же время, в нативной сетчатке отмечается высокий уровень экспрессии генов FGF2, Pax6, Six3, уч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.