ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 4, с. 244-253
УДК 591
МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ
ЭКСПРЕССИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ РЕГЕНЕРАЦИОННЫЕ
____V 1
ПОТЕНЦИИ ТКАНЕЙ глаза позвоночных1
© 2007 г. В. И. Миташов
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: mitashov@bk.ru Поступила в редакцию 22.01.07 г.
В статье впервые проведен сравнительный анализ ранних стадий преобразований дифференцированных клеток пигментного эпителия, эпителия цилиарных складок и мюллеровской глии в глазу позвоночных и млекопитающих в процессе регенерации сетчатки и при культивировании. При использовании клеточных, молекулярных и генетических маркеров охарактеризованы дедифферен-цирование и пролиферация клеток, формирование прогениторных мультипотентных клеток, которые являются источником регенерации сетчатки у взрослых тритонов. При культивировании дифференцированных клеток формируются нейросферы, в которых обнаружены прогениторные мультипотентные клетки, дифференцирующиеся в нейроны сетчатки и мозга и глиальные клетки. Сравнительный анализ изменений клеток пигментного эпителия в процессе регенерации сетчатки и при культивировании дифференцированных клеток пигментного и цилиарного эпителиев и мюллеровской глии свидетельствует о сходных преобразованиях клеток на ранних стадиях трансдиффе-ренцировки.
Ключевые слова: тритон, регенерация, сетчатка, клеточные источники, экспрессия генов.
Хорошо известно, что регенерационные потенции особенно ярко выражены у низших позвоночных животных. У амфибий в наиболее совершенной степени регенерируют конечность, хвост, хрусталик, сетчатка (Карлсон, 1986; Stocum, 1995, 2006; Tsonis, 1996; Brockes, 1997; Carlson, 1997; Eguchi, 1997; Thouveny, Tassava, 1997). Основная задача в изучении регенерации - понять механизмы восстановительных процессов. К настоящему времени накоплен достаточно большой экспериментальный материал при изучении регенерации, полученный с использованием морфологических, цитологических, иммунохимических и биохимических методов исследования. Для большинства моделей регенерации известны клеточные источники восстановления тканей и органов, изучены клеточные преобразования на разных уровнях в ходе восстановления разнообразных органов и тканей.
Цель статьи - провести сравнительный анализ клеточных преобразований на ранних стадиях трансдифференцировки клеток пигментного эпителия, эпителия цилиарных складок и мюллеровской глии в процессах регенерации хрусталика и сетчатки и при культивировании этих клеток.
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 05-04-48502).
Рассмотрены механизмы формирования прогениторных мультипотентных клеток и их дифферен-цировочные потенции, контролируемые сетью регуляторных генов и сигнальных молекул.
РЕГЕНЕРАЦИЯ СЕТЧАТКИ У ВЗРОСЛЫХ ТРИТОНОВ
Генетические исследования регенерации стали осуществимы при введении методов молекулярной биологии, которые позволили получить результаты для сравнительного анализа цитологических и молекулярно-генетических механизмов регенерации. Приближение к пониманию механизмов регенерации становится более реальным и продуктивным при изучении взаимодействия генов и их репрограммирования в процессе восстановления органов и тканей. Это направление исследований получает развитие в моделях регенерации планарий, а также конечности, хвоста, плавника, тканей глаза у позвоночных (Cellular and molecular..., 1997). Проведение таких исследований способствует объединению усилий генетиков и эмбриологов в исследованиях механизмов биологических явлений.
Очевидно, что в ходе развития или регенерации любого органа или ткани экспрессируются сотни и тысячи генов (Ahmad et al., 2004). Суще-
ЭКСПРЕССИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕНОВ Po C ПЭ СО
P
M
Рис. 1. Схема регенерации хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов: а - поперечный срез неоперированного глаза; б, в - стадии регенерации (приведены вдоль дорсовентральной оси) хрусталика (•), сетчатки центральной области дна глаза (в, см. на а).
Р - роговица; Ро - ростовая зона; С - сетчатка; ПЭ - пигментный эпителий; СО - сосудистая оболочка; X - хрусталик; М - митоз.
1 - 5-10-е сут после операции, дедифференцировка (депигментация) клеток ПЭ и инициация их пролиферации, митозы в слое ПЭ; 2 - 14-е сут после операции, двухслойный зачаток сетчатки (нейроэпителий); 3 - 20-е сут после операции, многослойный недифференцированный зачаток сетчатки, митозы локализованы в наружном слое зачатка; 4 -30-35-е сут после операции, дифференцировка клеток регенерировавшей сетчатки (из: Миташов и др., 2000).
a
ствуют ли среди них так называемые "регенера-ционные", запускающие процесс регенерации? Наш опыт исследования при внедрении методов молекулярной биологии в изучении регенерации показывает, что ответ на этот вопрос отрицательный. Методом геновычитания нам удалось идентифицировать гены, преимущественно экс-прессирующиеся в дорсальной области радужки -источнике регенерации хрусталика, но специфические "регенерационные" гены так и не были идентифицированы (Казанская и др., 1995; Мар-китантова и др., 1997). Поиск генов, специфически экспрессирующихся в дорсальной области радужки, продолжается, и недавно опубликованы данные об экспрессии определенного набора генов, локализованных исключительно в дорсальной области радужки, - это гены сигнального пути Wnt и их рецепторов: Wnt2b и (Hayashi е! а1., 2006). Экспрессия этих генов обнаружена на стадии инициации формирования хрусталика, чему предшествует депигментация и дедифференцировка клеток дорсальной области радужки. Существенным результатом исследования являются данные о двустадийном процессе регенерации хрусталика. Первая стадия - дедифференцирова-ние клеток дорсальной и частично вентральной области радужки, активация пролиферации кле-
ток, увеличение уровня экспрессии ранних хру-сталиковых факторов транскрипции Pax6, Sox2, MafB по всей поверхности радужки. Для последующей второй стадии ключевым событием, определяющим, завершится ли регенерация формированием хрусталика, является активация определенного специфического набора генов Wnt2b, Frizzled4, Soxl, Proxl, |3-у-crystallins в результате, вероятно, дерепрессии генов в дорсальной области радужки (Mitashov et al., 1992; Del Rio-Tsonis et al., 1995; Mizuno et al., 1999, 2002; Hayashi et al., 2006). Отмеченный набор генов не экспрессиру-ется в вентральной области радужки и хрусталик из этой зоны радужки не регенерирует (Hayashi et al., 2006).
Регенерация сетчатки и хрусталика у взрослых тритонов - одна из наиболее известных и активно разрабатываемых моделей трансдифференци-ровки клеток (рис. 1). Из рисунка очевидно, что, как уже отмечено, хрусталик регенерирует из дорсальной области радужки, но не регенерирует из противоположной вентральной радужки, а сетчатка регенерирует как из клеток ростовой области, так из пигментированных клеток пигментного эпителия, большая часть сетчатки образуется в результате трансдифференцировки пигментного
Рис. 2. Экспрессия гена Pax6 в нейробластах зачатка сетчатки на 22-е сут после удаления сетчатки у взрослых тритонов, гибридизация in situ: а - контроль, б -опыт.
ЗС - зачаток сетчатки (нейробласты), ост. обозначения см. на рис. 1. Увел. х200.
эпителия. Регенерация сетчатки в результате трансдифференцировки клеток пигментного эпителия также является двустадийным процессом. На первой стадии, как и в ходе регенерации хрусталика, осуществляется дедифференцировка и активируется пролиферация клеток пигментного эпителия. Депигментирующиеся пролиферирую-щие клетки смещаются в полость глаза, где постепенно создается слой мультипотентных ней-робластов (рис. 1; 2). На второй стадии регенерации ключевые события касаются особенностей экспрессии генов в исходных клетках пигментного эпителия и в зачатке сетчатки - в нейробластах (Макарьев и др., 2002; Маркитантова и др., 2003, 2004; рис. 1; 3). В дифференцированной сетчатке в норме выявлена экспрессия регуляторных генов Рахб, Ргох1, Six3 в клетках ганглиозного и внутреннего ядерного слоев, но она не обнаружена в пигментном эпителии - источнике регенерации, где активны гены Мг/, контролирующие мелано-
генную дифференцировку пигментного эпителия. На стадии формирования мультипотентных нейробластов ингибируется экспрессия генов Mitf в пигментном эпителии и активируется экспрессия регуляторных генов Pax6, Proxl, Six3 в нейробластах (рис. 2). По нашим радиоавтографическим данным (Миташов, 1976), не выявлено включения предшественника синтеза меланина 3Н-ДОФА в депигментированные клетки пигментного эпителия, что свидетельствует о блокировании генов Mitf, контролирующих меланоге-нез. Антагонистические взаимодействия между генами Pax6 и Mitf (Planque et al., 2001) лежат в основе формирования мультипотентных нейробластов, восстанавливающих сетчатку. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в норме в клетках пигментного эпителия ген Pax6 не экспрессируется, и активация экспрессии этого гена происходит на стадии депигментации клеток, являющихся клеточным источником регенерации сетчатки. Эти результаты очень четко коррелируют с данными об изменении уровня экспрессии ключевых регуляторных генов на ранних стадиях развития глаз млекопитающих. Ген Pax6 экспрессируется в пигментном эпителии на стадии формирования глазной чаши, но при активации меланогенеза в результате взаимодействия фактора транскрипции, кодируемого геном Pax6, с промоторной областью гена Mitf экспрессия гена Pax6 резко снижается и не выявляется во взрослом глазу (Planque et al., 2001; Baumer et al., 2003). Превалирующей становится экспрессия генов Mitf, контролирующих мелано-генную дифференцировку пигментного эпителия.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в норме в клетках пигментного эпителия ген Pax6 не экспрессируется. Активация экспрессии этого гена происходит на стадии депигментации клеток, являющихся клеточным источником регенерации сетчатки (рис. 2).
Для понимания механизмов трансдифференцировки клеток пигментного эпителия ключевыми со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.