»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ¡995, том 21, № 8, с. 608 - 611
УДК 577.214.622
ЭКСПРЕССИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА В СОСТАВЕ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ
© 1995 г. Н. А. Нетесова#, В. С. Петров, Н. В. Чешенко, Н. А. Чикаев*, Э. Г. Малыгин, Н. П. Мертвецов*
Госуд/1рственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" -Институт молекулярной биологии, 633159, пос. Кольцово Новосибирской обл.; * Институт биоорганической химии СО РАН, 630090, Новосибирск Поступила а редакцию 10.06.94 г. После доработки 03,10,94 г.
Ген ангиогенина человека клонирова» в составе генома вируса осповакцины. Получен рекомби-нантный вирус, экспрессирующий ангиогенин. Уровень синтеза белка, направляемого р е комби-нантным вирусом, анализировали реакцией иммуноблотинга с моноклональными антителами к ан-гиогенину человека.
Ключевые слова: ангиогенин, клонирование, вирус осповакцины, экспрессия.
Ангиогенин человека является фактором роста, вызывающим пролиферацию эндотелия капилляров и, как следствие, рост кровеносных сосудов [1,2]. Совокупность литературных данных позволяет рассматривать ангиогенин как препарат, весьма перспективный для обработки ран, ожогов, язв, а также сердечно-сосудистых патологий, лечение которых остается весьма серьезной проблемой [21.
Крайне низкое содержание ангиогенина в природных тканях, возможно, обусловлено мощной функциональной активностью этого белка, поэтому история определения его аминокислотной последовательности была достаточно трудной, но имела успешное завершение. Применение наиболее высокоэффективных методик позволило установить его полную первичную структуру [3]. Было также показано, что ангиогенин не содержит углеводной части, т.е. не является гликопро-теином [4].
Изучение регуляции экспрессии и механизмов действия ангиогенина, равно как и возможностей его медицинского использования, сдерживается незначительным количеством этого белка в природных источниках. Отсюда естественны попытки получения его генно-инженерных продуцентов. Здесь имели место как успешные эксперименты, позволившие путем направленных мутаций получить усиление ангиогенной активности [5], так и эксперименты, которые, несмотря на их внешнюю безупречность, не дали ожидаемых результатов [6].
# А
Автор для переписки.
До сих пор экспрессию гена ангиогенина пытались реализовать в Е. coli, основываясь на том, что этот белок не требует гликозилирования для проявления функциональной активности [4J. В этом контексте необходимо отметить, что в бактериальных системах экспрессии ангиогенин продуцировался в виде химерного белка и соответственно имел на N-конце довесок, состоящий из бактериальных аминокислот, что, возможно, является причиной снижения его функциональной активности. С учетом данного обстоятельства основной целью нашего исследования было получение рекомбинантного продуцента, обеспечивающего биосинтез ангиогенина в чистом виде. В качестве э к сп р е с си р у ю те го вектора был использован вирус осповакцины, который имеет ряд преимуществ перед бактериальными векторами, так как при его использовании процессы модификации аминокислотной цепи и способ укладки продуцируемого белка проходят по эукариотическому типу и дополнительно к этому продуцируемый белок должен быть наиболее близок к природному аналогу за счет отсутствия бактериальных аминокислот на N-конце.
В настоящей работе клонировали синтетический ген ангиогенина человека, ранее экспресси-рованный в Е. coli [6, 7] в составе эукариотичес-кого вектора на основе вируса осповакцины. Экспрессия такого варианта гена в Е. coli привела к получению белка, обладающего сравнительно небольшой ангиогениновой активностью [6]. Используя в качестве вектора вирус осповакцины, способный к множественным модификациям синтезируемых белков, можно сопоставить
ЭКСПРЕССИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА
609
ангиогениновую активность продуктов экспрессии гена ангиогенина в составе Е. coli и в этой системе, а также выявить ограничения, накладываемые системой Е. coli на функциональную активность синтезируемого ангиогенина.
Представляемая работа является начальным этапом в решении данной задачи и посвящена клонированию гена ангиогенина человека в составе генома вируса осповакцины и получению рекомбинантного вируса, направляющего синтез ангиогенина.
В настоящей работе ген ангиогенина клонировали в составе плазмиды pVAR 15, несущей последовательность гена тимидинкиназы и промотор р7.5К вируса осповакцины [8] (см, схему). Чужеродный ген встраивали по уникальному сайту рестрикции Smal, находящемуся в полилинкере векторной плазмиды.
ДНК фага М13 со встроенным геном ангиогенина (М13 Aug) гидролизовали рестриктазами £coRI и НШШ. Незаполненные З'-концы ДНК достраивали фрагментом Кленова в присутствии четырех dNTP в концентрации 1 мМ, затем с помощью препаративного электрофореза в 5% П ААГ выделяли фрагмент ДНК размером 410 п. о. После этого линеаризованную эндонуклеазой Smal векторную плазмиду pVAR 15 обрабатывали в присутствии пятикратного молярного избытка клонируемого фрагмента ДНК-лигазой фага Т4.
Для исключения фона исходных кольцевых плазмид pVAP 15, образующихся при такой обработке, реакционную смесь гидролизовали эндонуклеазой Smal и полученным препаратом трансформировали клетки Е. coli штамма JM 103. Рес-трикционным анализом отбирали клоны Е. coli, содержащие рекомбинантные плазмиды. Ориентацию встроенного фрагмента также определяли рестрикционным анализом.
На следующем этапе ген ангиогенина встроили в тимидинкиназную область вируса осповакцины. При проведении трансфекции применяли кальцийфосфатный метод с последующей селекцией рекомбинантных вариантов вируса осповакцины в культуре клеток Huml43 (ТК~). В качестве селектирующего агента использовали бромдезок-сиуридин в концентрации 50 мкг/мл культураль-ной среды (см. "Экспер. часть").
Нами были получены варианты вируса осповакцины, способные расти в присутствии бромде-зоксиуридина в культуральной среде, что свидетельствует об успешном введении в тимидинки-назный район ДНК вируса осповакцины гена ангиогенина.
Наличие встройки гена ангиогенина в реком-бинантный вирус осповакцин проверяли методом блот-гибридизации. По описанной ниже методике был приготовлен 32Р-меченый зонд, содержащий ген ангиогенина, и проведена гибридизация его с ДНК рекомбинантного вируса, иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре. Было
р7.5К
Smal
EcoR]
ТК2
Ang
ДНК-лигаза Smal
р7.5К
tfwdlll
ЕсоRI, HindUl Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы
ТК2
Схема клонирования гена ангиогенина человека в плазмиду рУАР 15. Затемнены фрагменты гена тнмидинкиназы вируса осповакцины (ТКI и ТК2).
610
НЕТЕСОВА и др.
V
12 3
Иммуноблотинг белков клеток, инфицированных ре-комбинантным вирусом осповакцины с моноклональ-ными антителами к ангиогенину. 1,2- отобранные клоны рекомбинантного вируса осповакцины; 3 - ли-зат клеток Hum 143 (ТК"), инфицированных вирусом осповакцины (штамм WR).
показано, что полученный зонд гибридизуется с рекомбинантной ДНК вируса осповакцины.
Отобранные клоновые варианты вируса осповакцины анализировали в реакции иммунобло-тинга с моноклональными антителами к ангиогенину человека. В реакции иммуноблотинга выявлялся белок с мол. массой 14.5 кДа, соответствующей мол. массе ангиогенина человека. При этом из 12 клонов 3 реагировали с моноклональными антителами (рисунок). Клоны пассировали далее на клетках Huml43 (ТК"). Показано, что отобранные клоны реагируют с моноклональными антителами к ангиогенину человека после пяти пассажей на культуре клеток Hum 143 (ТК"). Этот результат свидетельствовал о стабильности встроенного гена ангиогенина в составе рекомбинантного вируса осповакцины.
Таким образом, в настоящей работе ген ангиогенина человека был клонирован в составе генома вируса осповакцины и получен рекомбинант-ный вирус, направляющий синтез ангиогенина.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали вирус осповакцины штамма WR, культуру клеток Ниш 143 (ТК") из коллекции НПО "Вектор", моноклональные ан-
титела к рекомбинантному ангиогенину ("Фер-ментас", Литва), рестриктазы, ДНК-лигаЗу фага Т4, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Е. coli (ТОО "Сибэнзим", Новосибирск), дезоксинукле-озидтрифосфаты (dNTP) (Sigma, США).
Плазмидная ДНК pVAR 15, несущая последовательность гена тимидинкиназы и промотор р7.5К вируса осповакцины, предоставлена И.П. Дмитриевым (НПО "Вектор"). ДНК фага М13, содержащая ген ангиогенина, получена от С.П. Коваленко (Институт терапии СО РАМН, Новосибирск).
Клонирование ДНК, выделение плазмидных ДНК, гидролиз рестриктазами, репарацию концов фрагмента ДНК, циклизацию ДНК-лигазой, трансформацию клеток Е. coli JM103 проводили стандартными методами [9].
Вирус нарабатывали на роллерной культуре клеток Hum 143 в соответствии с условиями, описанными в работе [10]. Выделение вируса из инфицированных клеток проводили по методу [11].
Эксперименты по получению рекомбинантных вариантов вируса осповакцины осуществляли на культуре клеток Huml43 (ТК") по методикам, предложенным в работах [12, 13]. Клонирование проводили трижды предельными разведениями по методу, описанному в работе [10].
Пассирование рекомбинантного вируса осуществляли на монослойной культуре Huml43 (ТК~), используя вносимую множественность заражения 1 БОЕ/кл. Время инкубации зараженных клеток на каждом пассаже составляло 24 ч при 37°С. Содержание 5-бром-2-дезоксиуридина в среде во время селекции и пассирования составляло 50 мкг/мл. Проведено 5 пассажей рекомбинантного вируса.
Выделение ДНК вируса осповакцины. К 2 мл очищенного препарата рекомбинантного вируса (в 48% сахарозе) добавляли лауроилсаркозилат натрия до концентрации 4% и 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 10%. Полученную смесь инкубировали 3 ч при 37°С. Затем добавляли 500 мкг протеиназы К и инкубировали еще 1 ч, после чего добавляли 2 мл фенола, насыщенного буфером (0.02 М трис-HCl (pH 7.6), 0.01 М EDTA), осторожно встряхивали и центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Верхнюю фазу (фенол) убирали, а к нижней добавляли еще 2 мл фенола, центрифугировали, убирали фенол. Раствор ДНК дважды экстрагиров
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.