БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 7, с. 972 - 983
УДК 577.322.23
ЭКСПРЕССИЯ ЦИТОХРОМА b5 ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ В Escherichia coli. ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕМОПРОТЕИДА И ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С БЕЛКАМИ-ПАРТНЕРАМИ*
© 2006 г. Г.В. Сергеев1, А.А. Гилеп1, Р.У. Эстабрук2, С.А. Усанов1**
1 Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141 Минск, ул. Академика Купревича, 5/2; факс: 375(172)63-7274, электронная почта: usanov@iboch.bas-net.by 2 Department of Biochemistry, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 5323 Harry Hines Blvd., Dallas, TX, 75235-9038, USA; E-mail: RonaldEstabrook@UTSouthwestern.edu
Поступила в редакцию 24.01.06 После доработки 23.02.06
Приведены результаты экспрессии в Escherichia coli и выделении полноразмерной формы рекомбинантного цитохрома b5 внешней мембраны митохондрий, а также характеристика этой формы. Оптимизацией условий экспрессии цитохрома b5 внешней митохондриальной мембраны достигнут уровень экспрессии вплоть до 104 нмоль гемопротеида на 1 л культуры. Рекомбинантный цитохром b5 внешней митохондриальной мембраны выделен и очищен из солюбилизата клеточных мембран с помощью металлоаффинной хроматографии, обладает физико-химическими, спектральными и иммунохимическими свойствами цитохрома b5 внешней митохондриальной мембраны крысы. Иммобилизованный рекомбинантный цитохром b5 внешней митохондриальной мембраны использован в качестве аффинного лиганда для хроматографии электрон-транспортных белков. Показано, что при взаимодействии NADPH : цитохром Р450-редуктазы и изо-форм цитохрома b5 важную роль играют гидрофобные контакты между белками, хотя вклад этих взаимодействий в комплексообразование NADPH : цитохром Р450-редуктазы с изоформами цитохрома b5 различен.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: микросомальный цитохром b5, цитохром b5 внешней митохондриальной мембраны, экспрессия в Escherichia coli, аффинная хроматография, очистка белков.
В клетках гепатоцитов представлены две формы цитохрома Ъ5 [1]. Одна из них связана с мембранами эндоплазматического ретикулума (микросомальный цитохром Ъ5, Ъ5), другая — с внешней мембраной митохондрий (митохонд-риальный цитохром Ъ5, Ъ5от). Оба цитохрома Ъ5, несмотря на взаимодействие с различными мембранными структурами клетки, заякорены в мембране посредством С-концевого, гидрофобного фрагмента, который достаточно консервативен у представителей млекопитающих, насекомых, растений и прокариот [2, 3]. В отличие от микросомального митохондриальный цито-
Принятые сокращения: ИПТГ — изопропил-рО-ти-огалактозид, ДТТ — дитиотреитол, ФМСФ — фенилметил-сульфонилфторид.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-014, 23.04.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
хром Ъ5 в настоящее время обнаружен в основном у млекопитающих (главным образом в печени и семенниках) [4, 5]. Несмотря на различную локализацию в мембранных структурах клетки и на то, что оба цитохрома Ъ5 кодируются разными генами, гидрофильные фрагменты двух форм цитохрома Ъ5, содержащие гемовую группу [6], проявляют высокую степень гомологии. Секве-нирование генома ряда организмов позволило показать присутствие цитохрома Ъ5 внешней мембраны митохондрий в ряде органов и тканей высших организмов и установить их аминокислотную последовательность, но не прояснило функциональной значимости данного гемопро-теида.
Микросомальный и митохондриальный ци-тохромы Ъ5 имеют общую структурную организацию и включают в себя гидрофильный гемсвя-зывающий домен (~100 аминокислот), сохраняющий спектральные параметры гемопротеида, и гидрофобный, ответственный за связывание с
мембраной домен, включающий в себя ~40 аминокислот. Последний содержит собственно гидрофобный домен (~20 аминокислот), который связан с мембраной, и С-концевой гидрофильный фрагмент, экспонированный на поверхности мембраны [7]. В С-концевом гидрофильном фрагменте записана информация о месте транслокации гемопротеида после его биосинтеза либо в мембраны эндоплазматического ретикулу-ма, либо во внешнюю мембрану митохондрий [8]. Считается, что присутствием в С-концевом гидрофильном фрагменте цитохрома Ь5 внешней митохондриальной мембраны положительно заряженных аминокислот определяется его транспорт в митохондрии, а снятие заряда приводит к его транспорту в мембраны эндоплазма-тического ретикулума [8].
Сравнение первичной структуры микросо-мального и митохондриального цитохромов Ь5 (рис. 1) показывает, что митохондриальный ге-мопротеид несколько длиннее (134 и 146 аминокислот соответственно), содержит дополнительные аминокислоты в ^-концевой последовательности и значительно отличается в С-концевом гидрофобном фрагменте [9]. Интересно, что значение окислительно-восстановительного потенциала митохондриального гемопротеида сдвинуто на 100 мВ в отрицательную область по сравнению с микросомальным цитохромом Ь5 [10], а гемовая группа у митохондриального цитохрома Ь5 жестче связана с апобелком [11].
Основная функция микросомального цито-хрома Ь5 — участие в различных типах электрон-транспортных реакций. Цитохром Ь5 переносит электроны от МАБИ на стеарил-СоА-десатура-зу, которая катализирует окисление жирных кислот с образованием ненасыщенных липидов
[12], участвует в гидроксилировании сАМР-М-ацетилнейраминовой кислоты [13, 14] и выступает в качестве непосредственного переносчика электронов в МАБИ-зависимом восстановлении метгемоглобина до гемоглобина в эритроцитах [15]. Показано прямое взаимодействие этого гемопротеида с МАОРИ: цитохром-Р450-редуктазой [16—18], различными формами мик-росомальных цитохромов Р450 [19—27], а также с митохондриальными цитохромами Р450 (цитохромом Р450еаш [28, 29] и цитохромом Р4508ее [30, 31]). Значительную роль играет цитохром Ь5 в реакциях гидроксилирования стероидов ци-тохромом Р45017а в мембранах эндоплазмати-ческого ретикулума ряда стероидогенных тканей [32, 33].
Цитохром Ь5 образует специфические комплексы со многими электрон-транспортными белками, такими как цитохром с и миоглобин [34—37]. Показано существование специфичного участка на молекуле цитохрома Ь5, включающего в себя остатки Glu52, Glu48, Азр64 и экспонированный пропионат гемовой группы, который вовлекается во взаимодействие с электрон-транспортными белками [38].
Роль митохондриального цитохрома Ь5 в мо-нооксигеназных реакциях не ясна. Доказано его участие в восстановлении цитозольного семиде-гидроаскорбата посредством транспорта электрона с МАОИ на МАОИ : цитохром Ь5-редуктазу и семидегидроаскорбатредуктазу [39]. Недавно было показано, что митохондриальный цито-хром Ь5 стимулирует синтез половых гормонов, катализируемый цитохромом Р45017а в семенниках [5, 40]. Это вызывает значительный интерес, так как, несмотря на близость пространственных структур гидрофильных фрагментов
Рис. 1. Сопоставление последовательностей цитохромов Ь5 из различных видов организмов. Черным цветом выделены абсолютно консервативные остатки аминокислот, темно-серым и светло-серым — аминокислоты, идентичные в 80 и 60% случаях соответственно
микросомального и митохондриального цито-хромов b5 [8], эти цитохромы имеют совершенно разные функциональные характеристики.
В последнее время разработаны различные системы для гетерологической экспрессии микросомального цитохрома b5, которые позволяют получать рекомбинантный цитохром b5 [41—48]. Такой подход успешно использован для исследования структурно-функциональных закономерностей в цитохроме b5 с помощью направленного мутагенеза [49, 50], для выяснения механизма взаимодействия его С-концевой последовательности с мембранными структурами [51], а также для изучения механизма электронного транспорта [52, 53]. Вместе с тем для мито-хондриальной изоформы гемопротеида отсутствуют методы гетерологической экспрессии полноразмерного гемопротеида, что значительно затрудняет функциональную характеристику митохондриального цитохрома b5.
Наша цель — конструирование векторов для гетерологической экспрессии полноразмерной формы митохондриального цитохрома b5 в Escherichia coli, разработка эффективного метода выделения и очистки рекомбинантного цитохрома b5, сравнение его физико-химических свойств со свойствами микросомального цито-хрома b5 и использование его в качестве аффинного лиганда для ряда электрон-транспортных белков.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали холестерин, прегне-нолон, холат натрия, 3-[(3-холамидопропил)ди-метиламмоний] -1 -пропансульфонат (CHAPS), DS-Na, трипсин, ингибитор трипсина, кумасси R-250, BrCN-активированную сефарозу 4В, се-фадекс G-25, сефадекс G-75, сефакрил S-200 («Pharmacia», Швеция), альбумин, NADPH, аминобутил-сефарозу 4В («Sigma», США), Emulgen 911, Emulgen 913 («Kao Atlas», Япония), фенилметилсульфонилфторид, легкоплавкую агарозу, изопропил^^-тиогалактопиранозид, дитиотреитол (BRL, США), бактотриптон и дрожжевой экстракт («Difco», США).
Плазмиды и бактериальные штаммы. Для клонирования продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовался набор реактивов pCRTMII («Invitrogene», США) или pGEM-T-вектор («Promega», США). Экспрессионный вектор pCWori+ был любезно предоставлен М. Ватерманом (Университет Вандербилт, США) с разрешения А. Рот.
Конструирование экспрессионных плазмид. кДНК, кодирующую полноразмерную молекулу
митохондриального цитохрома b5 крысы (Rattus norvegicus), амплифицировали с помощью ПЦР в присутствии следующих праймеров:
OMB - 5'Nde (TGTATCATATGGCTACTCCAG-AAGCCAGCGGCAGCGGCAGG),
OMBch - 3'Xba (GCATGTCGACTCTAGACGG-AGGATTTGCTGTCAGCCCAG),
OMB - 3'Sal (GCATGTCGACGAGGATTTGCT-GTCAGCCCAG).
Праймеры конструировали на основе нукле-отидной последовательности митохондриально-го цитохрома b5 крысы [54]. 5'-Праймер (N-кон-цевой праймер) позволял включить в N-конце-вую последовательность дополнительный сайт рестрикции NdeI, который в последующем использовался для клонирования в экспрессионный вектор. 3'-Антисмысловые праймеры (С-концевые праймеры) содержат сайт рестрикции XbaI или Sali. Первый праймер позволяет амп-лифицировать кДНК, кодирующую цитохром b5 с неизмененной С-концевой последо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.