УДК 577.152.1
ЭКСПРЕССИЯ ЦИТОХРОМА P450scc В КЛЕТКАХ Escherichia coli: ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ РЕДОКС-БЕЛКАМИ*
© 2006 г. В.М. Шкуматов1, В.Г. Радюк1, Я.В. Фалертов1, А.А. Виноградова2, В.Н. Лузиков2, Л.А. Новикова2**
1 НИИ физико-химических проблем БГУ, Ленинградская 14, 220050 Минск, Беларусь
2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. Ломоносова, 119992 Москва, Россия; факс: (495)939-3181, электронная почта: novik@genebee.msu.su
Поступила в редакцию 21.03.06 После доработки 28.04.06
В качестве модели для изучения топогенеза цитохрома P450scc использовали клетки Escherichia coli, экспрессирующие зрелую форму цитохрома P450scc из митохондрий коры надпочечников быка. Рекомби-нантный P450scc выявлен как в мембранной, так и в растворимой фракциях, полученных центрифугированием клеточного гомогената в стандартных условиях. Методом гель-проникающей ЖХВД установлено, что в растворимой фракции цитохром P450scc находится исключительно в составе частиц размером более 400 кДа. Эти данные, подтвержденные методами аффинной хроматографии и кинетическими измерениями, позволяют предполагать, что частицы, содержащие цитохром P450scc, представляют собой сложные липо-протеиновые структуры. Растворимый цитохром P450scc в клетках E. coli не обнаружен, следовательно, встраивание в мембрану является необходимой стадией формирования холофермента. При добавлении NADPH цитохром P450scc в растворимой фракции подвергается одноэлектронному восстановлению и катализирует превращение 22Я-гидроксихолестерина в прегненолон. Таким образом, впервые показана возможность функционального сопряжения цитохрома P450scc млекопитающих с электрон-транспортной системой бактерий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитохром P450scc, Escherichia coli, встраивание в мембрану, функциональное сопряжение.
Цитохром Р4508сс (СУР11А1) — компонент стероидгидроксилирующей системы митохондрий коры надпочечников млекопитающих, катализирует реакцию превращения холестерина в прегненолон — ключевую стадию синтеза стероидных гормонов. В клетках коры надпочечников цитохром Р4508сс синтезируется на свободных полисомах в виде предшественника, несущего на Оконце отщепляемую сигнальную последовательность [1, 2]. Предшественник им-
Принятые сокращения: Ад — адренодоксин; АдР — адренодоксинредуктаза; СМЧ — субмитохондриальные частицы; ЖХВД — жидкостная хроматография высокого давления; ТСХ — тонкослойная хроматография; ДТТ — 1,4-дитиотреитол; ФМСФ — фенилметансульфонилфто-рид; ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-070, 11.06.06.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
портируется в митохондрии, где подвергается протеолитическому процессингу и встраивается во внутреннюю митохондриальную мембрану [3].
Цитохром Р4508сс — необычный белок. При анализе его первичной структуры не выявлены протяженные участки, обогащенные неполярными аминокислотными остатками, которые могли бы служить трансмембранными доменами белка [4, 5]. В то же время при обработке карбонатом натрия цитохром Р4508сс не вымывается из внутренней митохондриальной мембраны [6], то есть формально он может быть причислен к интегральным мембранным белкам. Более того, на основе данных по связыванию отдельных участков полипептида со специфическими антителами в препаратах митопластов и вывернутых субмитохондриальных частиц, была предложена модель, согласно которой цитохром Р4508сс состоит из двух доменов, каждый из которых пересекает внутреннюю митохондриаль-
1091
6*
ную мембрану [7]. Эксперименты с ингибиторами и акцепторами электронов, проникающими через липидный бислой с разной эффективностью, показали, что центр связывания субстрата Р4508СС обращен в митохондриальный матрикс [8].
Позднее, при анализе вращательной диффузии Р4508СС в протеолипосомах [9], а также при проведении электронной микроскопии препаратов протеолипосом (метод замораживания-скалывания) [10] было показано, что цитохром Р4508СС в таких частицах погружен в липидный бислой, однако не пронизывает его. Несмотря на то, что использование протеолипосом позволяет получить представление о характере взаимодействия цитохрома Р4508СС с фосфолипид-ным бислоем, эта модель не применима для изучения топогенеза белка. Фактически в основе таких модельных экспериментов лежит встраивание зрелого холофермента в липосомы — процесс, маловероятный в природе. Напротив, согласно современным представлениям, в большинстве случаев процесс импорта белков во внутреннюю митохондриальную мембрану включает в себя стадию транслокации через мембрану развернутой полипептидной цепи с последующим сворачиванием/связыванием гема/встраи-ванием в мембрану [11—13].
Более приближенной к естественным условиям представляется модель на основе клеток Е.еоН. Вада А. и др. [14] первыми показали, что при экспресии зрелой формы цитохрома Р4508СС белок оказывается встроенным в цито-плазматическую мембрану бактериальной клетки и каталитически активным (то есть, правильно свернутым и связавшим гем). Недавние исследования мембранной топологии цитохрома Р4508СС на модели клеток Е.еоН методом сайт-специфического мутагенеза и флуоресцентной микроскопии [15] показали, что молекула цитохрома Р4508СС контактирует с липидным бислоем посредством так называемой F-G-петли, расположенной в средней части полипептидной цепи. Мутации в области, кодирующей F-G-петлю7 приводили к увеличению содержания рекомби-нантного белка в растворимой фракции Е.еоН [16]. Кроме того, в связывании с мембраной Е.еоН принимает участие М-концевая А'-спи-раль. При ее удалении снижается сродство цитохрома Р4508СС к мембране, что также проявляется в увеличении содержания рекомбинантно-го белка в растворимой фракции [15]. В указанных работах [15, 16] показано наличие рекомби-нантного цитохрома Р4508СС как в мембранной, так и в растворимой фракции клеток, полученных после высокоскоростного центрифугирования гомогената, однако к настоящему моменту
данные о физическом состоянии цитохрома Р4508СС в растворимой фракции отсутствуют.
Более детальное изучение свойств и внутриклеточной локализации Р4508СС, экспресси-рованного в Е.еоН, может пролить свет на очередность и взаимосвязь отдельных этапов топо-генеза этого белка. Очевидно, в первую очередь заслуживают внимания следующие вопросы: является ли процесс встраивания полипептида СУР11А1 в цитоплазматическую мембрану ко-трансляционным или посттрансляционным, происходит ли связывание гема до или после встраивания полипептидной цепи в мембрану и является ли встраивание в мембрану необходимым условием для правильного сворачивания полипептидной цепи цитохрома Р4508СС.
Целью работы было выяснение внутриклеточной локализации цитохрома Р4508СС, экспрес-сированного в клетках Е.еоН, и определение физического состояния белка в растворимой фракции.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использованные клеточные штаммы, плазми-ды и среды. В работе использовали клетки E.coli штамма JM-109 («Promega», США) и плазмиду pTrc99^ с гибридным промотором trp/lac/trc [17]. Плазмида pTrc99A/mCYP11A1, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелую форму цитохрома P450scc из коры надпочечников быка, была любезно предоставлена доктором Ватерманом (Университет Ван-дербилдт, США) [14]. Среды для выращивания готовили, используя реактивы фирмы «Difco» (США).
Экспрессия цитохрома Р450scc в клетках E. coli.
Экспрессию зрелой формы CYP11A1 в клетках E.coli проводили, как описано ранее [14]. Компетентные клетки бактерий трансформировали рекомбинантной плазмидой, используя стандартную процедуру [18]. Экспрессию гена индуцировали, добавляя изопропил-1-тио^^-галак-тозид (0,5 мМ) в среду роста. В качестве дополнительного источника гема использовали S-аминолевулиновую кислоту (0,5 мМ). Культуру инкубировали в течение 40 ч при 24° при постоянном перемешивании (140 об/мин).
Фракционирование клеток E.coli. Клетки бактерий из 1 л культуры с ^600 ~ 6—7 собирали центрифугированием (7500 g, 10 мин) и промывали буфером (10 мМ Hepes, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4). Затем клетки суспендировали в буфере для разрушения (20 мМ Na-фосфат, pH 7,4, 5 мМ MgSO4, 0,2 мМ ФМСФ, 4 мМ ДТТ) и разрушали с помощью пресса Френча (максимальное давление 16 000 psi). Полученный гомогенат цент-
рифугировали 15 мин при 14 000 g для удаления крупных фрагментов клеток и телец включения, которые могут образовываться при синтезе гете-рологичного белка. Осветленный супернатант подвергали высокоскоростному центрифугированию при 120 000 g в течение 1 ч. Осадок, представляющий собой вывернутые мембранные везикулы, суспендировали в 50 мМ Na-фос-фатном буфере, pH 7,4. Суспендированный осадок и супернатант смешивали с глицерином (конечная концентрация 20%) и хранили при —20°. Для получения сферопластов клетки осаждали (3000 g, 5 мин), суспендировали в 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 5 мМ ЭДТА, инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре и вновь осаждали (3000 g, 5 мин). Полученный осадок суспендировали в 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0 c 5 мМ ЭДТА и 0,25 M сахарозы и добавляли лизоцим (0,15 мг/мл). За образованием сферо-пластов наблюдали с помощью микроскопа. Процесс формирования сферопластов прерывали добавлением MgCl2 (конечная концентрация 100 мМ).
Спектральный анализ. Концентрацию цитохрома P450scc в клеточных фракциях определяли из СО-разностных спектров препаратов, восстановленных дитионитом натрия, используя коэффициент молярного поглощения (мМ-1 см-1) е450-490 = 91 для нативной и е420-490 = 110 для денатурированной формы [19]. Концентрации ад-ренодоксина (Адх) и адренодоксинредуктазы (АдР) определяли из абсолютных спектров поглощения окисленных образцов белков с использованием е414 = 9,8 мМ-1 см-1 и е455 = 11 мМ-1 см-1 соответственно [20].
Высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД). ЖХВД проводили на хроматографе Shimadzu LC-10AD («Shimadzu», Япония) с использованием UV/VIS фотодиодного детектора SPD-M10A. Для гель-проникающей хроматографии применяли колонку 0,8 х
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.