НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 1, с. 57-63
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.82+616.8
ЭКСПРЕССИЯ ВЫСОКОАФФИННЫХ РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОТРОФИНОВ TгkA И TгkB В ГИППОКАМПЕ КРЫС ПОСЛЕ ИНТРАЦЕРЕБРОВЕНТРИКУЛЯРНОГО ВВЕДЕНИЯ рЛ(25-35)
© 2015 г. М. Ю. Степаничев*, А. О. Тишкина, Н. А. Лазарева, Е. К. Мартьянова, Г. Р. Тухбатова, А. О. Кулагина, С. В. Саложин, Н. В. Гуляева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия
В работе исследовали изменения экспрессии высокоаффинных рецепторов нейротрофинов фактора роста нервов ТгкЛ и мозгового нейротрофического фактора ТгкВ в гиппокампе крыс в разные сроки после введения РЛ(25-35) в боковые желудочки мозга. Исследование экспрессии ТгкЛ и ТгкВ проводили с помощью иммуногистохимии и метода полимеразной цепной реакции в реальном времени. Показано, что интрацеребровентрикулярное введение РЛ(25-35) крысам приводило к долговременным изменениям в системе нейротрофинового сигналинга в гиппокампе. Экспрессия рецептора ТгкЛ увеличивалась через 28 дней, а экспрессия рецептора ТгкВ возрастала через 12 дней, а затем снижалась через 28 дней. Таким образом, изменения нейротрофинового сигналинга могут быть вовлечены в механизмы, которые отвечают за нарушения функции гиппокампа у крыс, вызванные РЛ(25-35).
Ключевые слова: бета-амилоид, фактор роста нервов, мозговой нейротрофический фактор, ТгкА, ТгкВ, гиппокамп, болезнь Альцгеймера.
DOI: 10.7868/S1027813315010112
ВВЕДЕНИЕ
Нейротрофины — небольшие молекулы, способные оказывать мощное воздействие на жизнедеятельность нервных клеток. Экспрессия нейротрофинов в мозге происходит в ответ на изменение функциональной активности нейронов, а также под влиянием ряда иных факторов, включая повреждение нервной ткани. Нейротрофиче-ские факторы, продуцируемые и секретируемые клетками-мишенями, взаимодействуют с рецепторами и ретроградно транспортируются от места секреции в иннервирующие клетки. У млекопитающих описаны четыре типа нейротрофинов, такие как фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF), мозговой нейротрофический фактор (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) и нейротрофины 3 и 4/5. Эффекты каждого из нейротрофинов опосредованы активацией одной или более из трех ре-цепторных тирозинкиназ (tyrosine kinase, TrkA, TrkB, TrkC). Помимо этого, все нейротрофины активируют рецептор нейротрофинов р75NTR, являющийся представителем суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. Нарушение баланса в системе нейротрофинов и их рецепто-
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, д. 5а; e-mail: m_step@pochta.ru.
ров приводит к нарушениям высших функций мозга и развитию нейропатологий, включая ней-родегенеративные заболевания. В частности, болезнь Альцгеймера (БА) рассматривают как патологию, связанную с дисфункцией путей метаболизма нейротрофинов [1]. В поддержку этого могут служить данные о нарушении созревания N0^ сопровождающемся накоплением его предшественника ргоМОБ в базальных ядрах переднего мозга [2]. Превращение proNGF в зрелый NGF имеет особое значение для функционирования холинергических нейронов переднего мозга. Произведенный клетками-мишенями NGF играет ключевую роль в выживании холинергических нейронов в процессе развития [3, 4] и поддержании холинергического фенотипа в мозге взрослых особей [5]. Однако, при нейродегенератив-ных патологиях, подобных БА, нарушение метаболизма NGF может приводить к возникновению холинергического дефицита.
NGF оказывает свои эффекты, действуя через высокоаффинный рецептор ТгкЛ и низкоаффинный рецептор p75NTR. Холинергические нейроны переднего мозга являются основной группой клеток, экспрессирующих эти рецепторы в ЦНС [6]. Помимо участия в поддержании холинергического фенотипа, взаимодействие NGF с его ре-
цепторами может оказывать влияние на процессы обучения и памяти [7]. У пациентов с БА нарушение метаболизма N0^ в мозге сопровождается снижением экспрессии ТгкА в коре больших полушарий и базальных ядрах [8—10]. Кроме того, нарушение процессинга N0^ и экспрессии ТгкА были обнаружены у людей с признаками мягкого когнитивного снижения [11]. Содержание proNGF и ТгкА отрицательно коррелировали с выраженностью патологических признаков у больных [12]. Оценка профиля экспрессии белков в единичном холинергичеком нейроне базальных ядер не выявила изменений в экспрессии p75NTR у пациентов с мягким когнитивным снижением или БА [8].
Холинергическая дисфункция тесно связана с развитием амилоидной патологии, которая является важной чертой БА [13]. Предполагают, что атрофия нейронов базальных ядер, сопровождающаяся снижением синтеза и высвобождения ацетилхолина, способствует расщеплению амилоидного белка-предшественника по амилоидо-генному пути [14]. Появление в ткани мозга Р-амилоида фА) или агрегированного РА может отрицательно воздействовать на холинергиче-скую систему, приводя к усилению холинергиче-ского дефицита и дегенерации нейронов в базаль-ных ядрах переднего мозга [15]. Введение натуральных или синтетических пептидов РА экспериментальным животным вызывало возникновение холинергического дефицита, связанного со снижением активности холинацетил-трансферазы (ХАТ) или усилением ацетилхо-линэстеразной активности [16—19]. Недавно было показано, что индукция амнезии и нейроде-генеративных процессов у крыс путем введения АР(25-35) приводила к снижению экспрессии ХАТ в холинергических нейронах медиального септального ядра (МСЯ), которое не было связано с гибелью этих клеток [20]. Эти изменения в экспрессии ХАТ появлялись вскоре после инъекции АР(25-35) в боковые желудочки мозга крыс, но до появления признаков клеточной гибели в гиппокампе.
В представленной работе исследовали изменения экспрессии ТгкА в гиппокампе, основной проекционной зоне и источнике NGF для холи-нергических нейронов МСЯ. Кроме того, исследовали экспрессию высокоаффинного рецептора ТгкВ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проведена на самцах крыс линии Вистар (питомник "Столбовая", Московская обл.). Животных содержали в условиях вивария при искусственном световом режиме (12 : 12 ч день/ночь) и свободном доступе к воде и пище по пять особей в клетке. Все эксперименты с животными проведены согласно требованиям международного и
российского законодательства; экспериментальный протокол утвержден этической комиссией ИВНД и НФ РАН.
Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата в дозе 350 мг/кг. Животным интрацеребровентрикулярно вводили нейроток-сичный фрагмент ßA(25-35) (Bachem, FRG), который предварительно агрегировали согласно протоколу [17]. Инъекции проводили билатерально в соответствии с координатами стереотаксиче-ского атласа [21]: AP —0.8 мм; L ±1.5 мм. Иглу микрошприца опускали на глубину 3.8 мм ниже кости черепа. ßA(25-35) вводили в дозе 7.5 нмоль в каждый желудочек (общая доза 15 нмоль). Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя (стерильной воды). Также в качестве контроля использовали группу интактных животных.
Через 6, 12 и 28 дней после введения ßA(25-35) крыс подопытной и контрольной групп (n = 5 для каждой временной точки) повторно анестезировали хлоралгидратом и перфузировали транскар-диально 4% раствором параформальдегида в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4). Мозг дофикси-ровали в том же фиксаторе в течение 24 ч при 4°C. Фронтальные срезы мозга толщиной 50 мкм готовили на вибротоме VT 1200S (Leica, FRG) и хранили при —18°C в криопротекторной жидкости до анализа. Иммуногистохимическую детекцию экспрессии TrkA и TrkB проводили на свободноплавающих срезах с использованием поликло-нальных антител кролика компании Santa Cruz Biotechnology (USA) в разведении 1 : 400 и 1 : 500, соответственно. Инкубацию с антителами проводили в течение ночи при 4°C. Связывание антител выявляли с помощью биотинилированных антител козы к IgG кролика (Sigma, USA) в разведении 1 : 800 и авидин-биотинового комплекса, конъюгированного с пероксидазой хрена (ABC Elite kit; Vector Laboratories, USA). В качестве хромогена использовали 3,3'-диаминобензидин (Sigma FAST kit; Sigma, USA).
Для оценки иммуногистохимического окрашивания измеряли оптическую плотность с помощью программы ImageJ (NIH; USA). Для этого получали изображения окрашенных срезов гип-покампа левого и правого полушария на микроскопе Leica DM-6000B (Leica, FRG), оснащенного CCD камерой Leica DFC310 FX. Использовали по три среза дорсального гиппокампа с расстоянием 600 мкм между ними от каждого животного. Поскольку распределение рецепторов имело разный характер, для оценки экспрессии TrkA фотографировали области пирамидных слоев клеток CA1, CA3 и гранулярного клеточного слоя зубчатой фасции (ЗФ), тогда как для оценки экспрессии TrkB фотографировали проводящие пути stratum radiatum, stratum oriens и хилуса ЗФ. В каче-
стве показателя использовали долю окрашенной площади, выраженную в процентах.
Другую часть животных (n = 3 для каждой временной точки и интактной группы) декапитиро-вали. Мозг вынимали и на льду выделяли гиппо-камп. Образцы сразу же замораживали в жидком азоте и использовали для анализа экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Ткань гомогенизировали и выделяли суммарную РНК с помощью TRI-реагента (Molecular Research Center, USA) согласно протоколу производителя. кДНК синтезировали с использованием полученной РНК, рандомизированных гексапраймеров, dNTP и обратной транскриптазы MultiScribe (TaqMan Reverse Transcription Reagents, Applied Biosystems, UK). Для оценки экспрессии Ntrkl (TrkA), Ntrk2 (TrkB) и Hprt методом ПЦР-РВ использовали праймеры со следующими последовательностями: для Ntrk1, F: 5'-CAACAGT-TGTGGTGTACCCTCAGTG-3' и R: 5'-ACTTC-CACAGAGTCATTGGGCA-3'; для Ntrk2, F: 5'-TTAGGGCACACGGGCCAGAT-3' и R: 5'-ATCTGCGACTGCGTCAGCTC-3'; для Hprt, F: 5'-GGTTAAGGTTGCAAGCTTGCTGGTGA-3' и R: 5'-CTTGTAGATTCAACTTGCCGCTGTCT-3'.
ПЦР-РВ проводили с помощью амплифика-тора 7500 RealTime PCR System (Applied Biosystems, USA) с использованием набора реагентов SybrGreen with ROX reagents (Applied Biosystems, UK). Результаты рассчитывали по кал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.