БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.6, c.975-983
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
ЭЛЕКТР ОСТАТИЧЕСКАЯ КАР ТА ГЕНОМА БАКТЕР ИОФАГА Т7. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛЕКТР О СТАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ^-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОМОТОРОВ Т7 ДНК, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИX С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ Escherichia coli
© 2009 г. С.Г. Камзолова*, А.А. Сорокин* **, А.А. Осипов*, П.М. Бескаравайный*
*Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области; **The University of Edinburgh, UK, EH9 3JR, Edinburgh, Kings Buildings E-mail: lptolik@gmail.com. Поступила в p едакцию 20.10.08 г.
Вычислен профиль распределения электростатического потенциала полного генома бактериофага Т 7. П роведен ср авнительный анализ электростатической и генетической карт Т 7 генома. Определена локализация промоторов на электростатической карте Т7 ДНК. Изучены электростатические свойства а -специфичных промоторов Т7 ДНК, взаимодействующих с РНК-полимеразой Escherichia coli. Найдена корреляция между электростатическими характеристиками промоторов и их функциональной активностью.
Ключевые елова: бактериофаг Т7, геном, промоторы, электро^атиче^ий потенциал, РНК-по-лимераза (Еа70), узнавание.
Для бактерий и бактериофагов основной контр оль в регуляции экспрессии генов о суще-ствляется на стадии транскрипции. Наиболее значимые механизмы регуляции транскрипции действуют на стадии узнавания РНК-полиме-разой промоторов и образования открытых пр омоторных комплексов [1]. C ледует отметить, что регуляция эффективности комплексообра-зования РНК-полимер азы с пр омоторной ДНК может осуществляться либо самой РНК-поли-меразой, обладающей дифференцированным сродством к разным промоторам, либо с помощью белков-регуляторов, специфических к индивидуальным пр омоторам. Главная форма РНК-полимеразы Escherichia coli - Еа70 - специфически узнает и образует транскрипционно активные комплексы с огромным количеством разнообразных промотор ов (~ 3500-4000) в геноме E. coli и близкородственных фагов. При этом активность многих из них, включая промоторы конститутивных генов E. coli и промоторы ранних генов бактериофагов, контролируются in vivo только самой РНК-полимеразой (Еа70). П ромоторы бактериофага Т7 являются наиболее репрезентативным пример ом этой группы промоторов. Такие промоторы представляют особый интерес для проблемы про-моторно-полимеразного узнавания, поскольку являются наиболее корректными объектами для исследования «в чистом виде» регуляторных
возможностей самой РНК-полимеразы и промотор ной ДНК.
Огромное количество промотор ов, с которыми специфически взаимодействует РНК-по-лимераза (Е а70), и большая вар иабельность их нуклеотидных последовательностей [2] указывают на сложность механизмов, вовлеченных в пр оцесс ДНК-белкового узнавания в этом случае. Согласно современным представлениям, не только нуклеотидная последовательность, но и физические свойства пр омоторной ДНК, задаваемые этой последовательностью, вносят вклад в обеспечение специфичности взаимодействия РНК-полимеразы с разными промоторами. К таким свойствам относятся наличие легкоплавких участков [3-5], изгибность двойной спирали и наличие изломов, шпилек и петель [6,7], а также динамические характер истики как самих промоторных участков, так и макромолекулы ДНК в целом [3,8,9].
В последнее время стало также известно, что регуляция активности промоторной ДНК может осуществляться через электростатические взаимодействия с РНК-полимеразой [10-14]. В частности, в электростатическом профиле дальней ^stream области пр омоторных ДНК р ан-них генов генома фага T4 были обнаружены специфические элементы, которые могут выступать в роли новых пр омоторных детерминант, внося свой вклад в промоторно-полимеразное
узнавание чер ез электростатические взаимодействия с а-субъединицей РНК-полимеразы [10,14-16]. Показано, что характер этих взаимодействий определяет функциональное поведение ранних промоторов фага Т4 и контролируемых ими генов в ответ на физиологический сигнал, связанный с АДФ-рибозилирова-нием а-субъединицы РНК-полимер азы [10,14]. Интересно, что аналогичные электростатические элементы были найдены в рибосомальных промоторах E. coli [11,12] и некоторых ^-специфичных синтетических пр омоторах, содержащих олиго-А треки в ^stream области [14]. И в этих случаях была найдена корреляция между типом специфических электростатических элементов и хар актером функционального поведения промотор ов. Все это указывает на широкое распространение в промоторах сигнальных элементов, формируемых на основе электростатических характеристик ДНК. Полученные недавно результаты, показывающие, что в пр оцессе эволюции в промоторах отбирались фрагменты последовательности с пониженным электростатическим потенциалом, подтверждают предположение о важности той роли, которую играет электростатический потенциал ДНК в формировании промоторной функции [17]. Таким образом, исследование электростатических свойств промоторных ДНК является перспективным подходом для поиска новых сигнальных элементов, вносящих вклад в формирование пр омоторной активности.
В данной работе было вычислено распределение электростатического потенциала вдоль полного генома бактериофага Т7. Проведено сравнение электростатической и генетической карт фагового генома и определена локализация всех промоторов на электростатическом пр офиле Т7 ДНК. Известно, что тр анскрипция на этой матрице осуществляется двумя разными РНК-полимеразами: E. coli Еа70 и Т7-кодируе-мой РНК-полимеразой. В данной работе рассмотрены электро статические свойства промоторов, специфически взаимодействующих с РНК-полимеразой E. coli. Этот фермент может инициировать синтез РНК с восьми промоторов Т7 ДНК - A1, A2, A3, B, C, D (A0), E и F. Все эти промоторы достаточно хорошо охарактеризованы биохимически [18-31]. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности и свойств этих промоторов свидетельствует о том, что их функциональное поведение не соответствует правилу «консенсусного промотор а» [23,25], что, в свою очередь, указывает на перспективность поиска в них новых сигнальных элементов, отличных от канонических промоторных детерминант. Полученные резуль-
таты позволяют пр едположить, что электр оста-тические характеристики промоторных ДНК могут вносить вклад во взаимодействие РНК-полимеразы с этими пр омоторами и фор миро-вание их функциональной активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нуклеотидная последовательность Т7 генома и локализация в ней промоторов, терминаторов и идентифицированных генов взяты из базы данных NCBI RefSeq (NC001604). Вычисление распределения электростатического потенциала вокруг двойной спирали ДНК проведено с использованием оригинального метода [32] в модифицированной форме [10]. Программное обеспечение для проведения компьютерных расчетов электростатического профиля ДНК разработано А.А. Сорокиным (lpto-lik@icb.psn.ru) [33]. Для анализа электростатических профилей а70-специфичных промотор ов Т7 ДНК использовались фрагменты величиной в 300 пар оснований (п.о.) (-200 —+ 100 п.о., где +1 п.о. - точка инициации тр анскрипции).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Геном Т7 фага содержит 39937 нуклеотидов, их последовательность известна [34]. Нами был рассчитан профиль электростатического потенциала вокруг всей ДНК фага Т7. Электр оста-тическая карта Т7 генома была сопоставлена с его генетической картой. Это позволило локализовать на электростатической карте Т7 генома профили, соответствующие промоторам, терминаторам и другим биологически значимым участкам ДНК. Полученные результаты представлены в базе данных DEPPDB (DNA Е1ес1го81а1;1с Profile Ргорегйе8 Database, Ьир://ргошоёе1лсЬ.р8п.ги).
В таблице суммир ованы данные о локализации всех известных промоторов на генетической карте бактериофага Т7 и представлен их классификационный анализ в зависимости от типа РНК-полимеразы, с котор ой они взаимодействуют, и характера и времени экспрессии генов, которые они контролируют.
Во время инфекции E. coli ранняя область Т7 генома транскрибируется хозяйской РНК-полимеразой (Еа70) с трех тандемно расположенных на левом конце сильных промотор ов A1, A2, A3 (рис. 1). Одним из основных генных продуктов этой области является Т7-специфи-ческая фаговая РНК-полимер аза, котор ая о су-ществляет транскрипцию средних (класс II) и поздних (класс III) генов Т7 ДНК. Следует отметить, что в отличие от мультисубъединич-
П p омотор ы генома бактериофага Т 7
Точка старта транскрипции Название пр о -мотора РНК-полимераза, контролирующая промотор Класс пр омотор а Направление считывания
224 A0 E. coli неидентефицирован справа
405 рЫОЬ T7 ранний слева
498 A1 E. coli ранний слева
626 A2 E. coli ранний слева
750 A3 E. coli ранний слева
1514 B E. coli ранний слева
3113 С E. coli ранний слева
5848 рЬй.ЬЛ. T7 ранний слева
5923 рЫ1.1В T7 ранний слева
6409 рЫ1.3 T7 ранний слева
7778 рЫ1.5 T7 класс II слева
7895 рЫ1.6 T7 класс II слева
9107 рЫ2.5 T7 класс II слева
11180 рЫ3.8 T7 класс II слева
12671 рЫ4с T7 класс II слева
13341 рЫ4.3 T7 класс II слева
13915 рЫ4.7 T7 класс II слева
18545 рЫ6.5 T7 класс III слева
21865 рЫ9 T7 класс III слева
22904 рЫ10 T7 класс III слева
27274 рЫ13 T7 класс III слева
32998 F E. coli неидентефицирован справа
34566 рЫ17 T7 класс III слева
36836 E[6] E. coli неидентефицирован слева
39229 phiOR T7 класс III слева
Рис. 1. Карта транскрипции Т7 ДНК РНК-поли-меразой E. coli. Левый край соответствует первому нуклеотиду последовательности Т7 ДНК, правый-39937. Одна единица карты - 399,37 п.о. П ромоторы А1, А2, А3 активны in vivo на ранней стадии инфекции E. coli бактериофагом Т7. Терминатор для РНК-полимеразы E. coli (ТЕ) находится в положении 7588 п.о. Участок ДНК от промотора А1 до терминатора ТЕ представляет собой единую транскрипционную единицу, составляющую раннюю область генома бактериофага Т7. (NCBI Ref-Seg #100124) Промоторы В, С, D(A0), Е и F проявляли активность только в экспериментах in vitro.
ной РНК-полимеразы E. coli, являющейся одним из самых больших бактериальных белков, Т7-специфичный фермент со стоит из одной небольшой субъединицы.
Соответственно и промотор ы, специфичные к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.