БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 5, с. 342-351
УДК 577.35
ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МОЗГА МОЛЛЮСКА Ьутпага stagnalis Ь. ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ В ЖИДКОМ АЗОТЕ (-196°С)
© 2014 г. Н. А. Ивличева1, И. А. Чистопольский2, Л. И. Крамарова3, Э. Н. Гахова1*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл., Институтская ул., 3;
*электронная почта:gakhova@gmail.com 2Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, 117434, Москва, ул. Вавилова, 26 3Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 3142290, Пущино, Московская обл.,
Институтская ул., 3 Поступила в редакцию 10.04.2014 г.
Изучение обратимой остановки жизнедеятельности нейронов в составе нервной ткани после ее криоконсервации является актуальным и востребованным. Длительное хранение жизнеспособного материала при температуре жидкого азота (—196°С) открывает новые возможности для биомедицины в области создания криобанка трансплантатов нервной ткани. В данной работе изучали восстановление электрофизиологической активности нейронов после глубокого замораживания на примере ганглиев мозга моллюска Ьутпава stagnalis Ь. Было проведено сравнение электрических характеристик (мембранных потенциалов, потенциалов действия) идентифицированных нейронов разных ганглиев при органотипическом культивировании криоконсервированного и не подвергавшегося криоконсервации мозга моллюска. Проанализирована сохранность функциональных связей между идентифицированными интернейронами ППеД1 педального ганглия, интернейронами ВД1, ВД4 и области ВА-кластера висцерального ганглия. Изучено влияние криопротектора диме-тилсульфоксида (ДМСО) на функциональную связь между идентифицированными нейронами мозга моллюска. Показано, что после криоконсервации мозга моллюска восстанавливались типичные паттерны электрической активности нейронов; нейроны генерировали постсинаптические потенциалы (ПСП), но функционально активных связей между идентифицированными нейронами разных ганглиев обнаружить не удалось. ДМСО не влиял на функционирование связей между нейронами, локализованными в разных ганглиях. Нарушение некоторых связей между нейронами могло быть вызвано криоповреждениями в нейропиле и в комиссурах, что подтверждается наличием ПСП нетипичного профиля.
Ключевые слова: криоконсервация, электрическая активность нейронов, изолированное окологлоточное кольцо ганглиев, моллюск Lymnaea stagnalis Ь.
Б01: 10.7868/80233475514050053
ВВЕДЕНИЕ
Криоконсервация — это современная перспективная биотехнология, которая позволяет длительно сохранять биологический материал в жизнеспособном состоянии при температуре жидкого азота. В настоящее время в медицине и ветеринарии успешно применяется низкотемпературное хранение однородных суспензий клеток с возможностью восстановления их биологических функций после оттаивания. Однако ткани, в
Сокращения: ДМСО — диметилсульфоксид, МП — мембранный потенциал, ПД — потенциал действия, ПСП — постсинаптический потенциал, ВПСП — возбуждающий постсинаптический потенциал, ЦНС — центральная нервная система.
том числе нервная ткань, плохо переносят крио-консервацию, а для целых органов методы криоконсервации пока не разработаны [1, 2]. Гетерогенный клеточный состав нервной ткани (разного типа нейроны и глиальные клетки), вненейрональные области, плотность упаковки клеток в структуре ткани делают невозможным экстраполировать протоколы криоконсервирова-ния с клеточных суспензий на ткань/орган. Изучение физиологической сохранности (или восстановления) после криоконсервации не отдельных нейронов, а всей системы мозга является важным аспектом в оценке жизнеспособности нейрональной ткани и органа [3, 4]. В этом плане простые нервные системы беспозвоночных, как
например мозг прудовика Lymnaea stagnalis L., могут представлять интерес для криобиологов в качестве модельных объектов для решения подобных задач. В 1989 году микроэлектродным методом фиксации потенциала на одиночных нейронах прудовика, изолированных из криоконсервированного мозга, нами было показано восстановление электрических параметров нейрональных мембран (МП, Явх, амплитуда и длительность ПД) [3].
Цель настоящей работы заключалась в изучении сохранения и восстановления в органной культуре электрофизиологической активности целого мозга моллюска после криоконсервации. Изучение особенностей криоповреждений и криозащиты мозга моллюска как целой интегральной структуры позволит определить области криоповреждений, прогнозировать степень восстановления и оценить используемые режимы криоконсервации и защитные свойства криопро-текторных сред.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на ганглиях изолированного окологлоточного нервного кольца (мозг) взрослого пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. Центральная нервная система, т.е. мозг моллюска, представляет собой окологлоточное кольцо ганглиев, соединенных между собой коннективами и комиссурами (рис. 1).
Криоконсервацию (замораживание до —196°С) мозга моллюска проводили в присутствии крио-протектора ДМСО (2 М) со скоростью 400— 500°С/мин [3]. Материал сохраняли в жидком азоте от 1 сут до 2 лет. Восстановление электрических свойств нейронов в составе ганглиев анализировали после оттаивания мозга моллюска, ступенчатого отмывания криопротектора и обязательного восстановительного периода в физиологическом растворе при 4—7°С в течение 1.5—2 ч (и более) [3]. После этого, как было показано в культуре изолированных клеток [5], нейроны были способны к регенерации, формированию новых нейрональ-ных отростков. Контролем служили нейроны ганглиев, которые не подвергались криоконсер-вации.
Для органотипического культивирования ганглиев был использован и модифицирован метод, описанный Гелетюком и Костенко с соавт. [6, 7]. Изолированный мозг моллюска (ганглии), предварительно освободив от толстой соединительнотканной оболочки, помещали в 2—4 мл питательной среды (90 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1.5 мМ MgCl2, 0.25 мМ трис—HCl, рН 7.6-7.9), без добавления сыворотки, но содержащей 20% среды L-15 (Sigma, США), применяемой при культивировании изолированных нейронов [7].
Смену среды проводили по мере того, как происходило ее закисление (от 2—3 до 6—9 сут). Обеззараживание осуществляли каждый раз при смене среды в растворе, содержащим 50 мкг/мл гента-мицина. Культивирование ганглиев моллюска после криконсервации проводили таким же образом. Срок культивирования в экспериментах составлял от 3 до 16 сут.
Для прижизненного окрашивания использовали Live/Dead Cell Double Staining Kit (L-3224, Molecular Probes, США) [8]. Двухкомпонентный флуоресцентный витальный краситель состоит из кальцеина-АМ (kex ~495 нм, ^em ~515 нм), который характеризует в живых клетках активность внутриклеточных эстераз (зеленая флуоресценция). Второй компонент красителя этидий гомодимер (^ex ~ 528 нм, ^em ~ 617 нм) тестирует целостность клеточной мембраны: он проникает в клетку с поврежденными мембранами, окрашивая нуклеиновые кислоты в мертвых клетах (красная флуоресценция). Флуоресценцию нейронов регистрировали на микроскопе Leica CTR DM 6000B при увеличении 2.5x, 20x и 40x.
Внутриклеточное отведение мембранных потенциалов осуществляли стеклянными микроэлектродами (ROT ~20—60 МОм) одновременно от нескольких нейронов, используя до 5 каналов. Для многочасовых электрофизиологических экспериментов использовали раствор следующего состава (мМ): 50 NaCl, 1.6 KCl, 2 CaCl2, 1.5 MgCl2, 10 трис—HCl, рН 7.5 [9]. Было проанализировано свыше 300 записей нейронной активности мозга.
Для анализа электрических характеристик (МП и ПД) выбирали нейроны, идентифицируя их по месту локализации (рис. 1): в буккальных ганглиях — нейроны Б1, Б2, Б3, Б4 и клетки кластера, прилегающего к нейрону Б4; в висцеральном ганглии — нейроны ВД1, ВД4 и ВА-кластера; в педальных ганглиях — нейроны в области А-кластера и нейрон П/ЛПеД1; в правом и левом париетальных ганглиях — группы клеток с вентральной стороны ганглиев; в церебральных ганглиях — парные нейроны Ц1. Регистрацию электрических характеристик нейронов ганглиев проводили через каждые 2—3 сут на протяжении 16 сут органотипического культивирования. Для записи сигналов нервных клеток была использована программа Spike-C3 (автор Д.Д. Воронцов).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Морфофункциональное состояние нейронов в ганглиях моллюска после криоконсервации в жидком азоте. Тестирование жизнеспособности ганглиев моллюска с применением витального красителя kit Live/Dead показало отсутствие флуоресценции нейронов в красном диапазоне спектра,
Рис. 1. Схема расположения идентифицированных нейронов, электрические показатели которых использовали для оценки жизнеспособности мозга Lymnaeastagnalis (предоставлена В.В. Цыгановым). Дорсальная сторона ЦНС. Перерезана церебральная комиссура, церебральные ганглии развернуты вентральной стороной. Отмечены идентифицированные нейроны, используемые в экспериментах.
ЛБГ и ПБГ — левый и правый буккальные ганглии соотв.; ЛЦГ и ПЦГ — левый и правый церебральные ганглии соотв.; ЛПлГ и ПплГ — левый и правый плевральные ганглии соотв.; ЛПаГ и ПпаГ — левый и правый париетальные ганглии соотв.; ЛПеГ и ПеГ — левый и правый педальные ганглии соотв.; ВГ — висцеральный ганглий. Отмечены нейроны Б1, Б2, Б3, Б4 в левом и правом буквальных ганглиях; ВА-кл — группа нейронов в области А-кластера и нейроны ВД1 и ВД4 в висцеральном ганглии; ПеА-кл — группа нейронов в области А-кластера и нейроны ЛПеД1 и ППеД1 в левом и правом педальных ганглиях; ЛЦеЦ1 ПЦеЦ1 гигантские нейроны правого и левого церебральных ганглиев. Обозначения и классификация нейронов даны согласно работам [10—12]. Приведена схема связи между нейронами висцерального ганглия ВА-кластера, ВД1 и ВД4 и нейроном педального ганглия ППеД1 по описанию в статьях [11—14].
что свидетельствует о сохранении целостности клеточных мембран. Флуоресценция в зеленом диапазоне спектра в телах нейронов и в нейро-нальных отростках оттаянных ЦНС указывает на сохранение внутриклеточной ферментативной эстеразной активности (рис. 2). Таким образом, нейроны в ганглиях после замораживания-оттаивания были живыми. Законо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.