РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 6, с. 707-716
^ РАДИАЦИОННАЯ ^^^^^^^^^^^^^^
БИОХИМИЯ
УДК 599:539.1.047
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ МОЧИ КРЫС В ДИНАМИКЕ ПОСЛЕ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ ДВУОКИСИ ТОРИЯ (ТОРОТРАСТА)
© 2007 г. Ю. С. Кулиш , К. П. Кашкин*
Медицинский радиологический научный центр РАМН РФ, Обнинск *Российская медицинская академия последипломного образования МЗ и СО РФ, Москва
Исследовали влияние однократного внутривенного введения крысам а-излучателя двуокиси тория (торотраста) на функцию почек путем динамического изучения состава белков мочи методами электрофореза и иммуноэлектрофореза в агаровом геле. В течение первых 3 мес после введения торотраста изменения белков мочи однотипны: появляются дополнительные низкомолекулярные, деградированные сыровоточные фракции-антигены, свидетельствующие о нарушении избирательности функции реабсорбции, свойственной проксимальным канальцам почек. В эти же сроки снижается экскреция в мочу почечных белков. Через 4-6 мес сокращается число дополнительных фракций и появляется нативный сывороточный альбумин, что обусловлено снижением избирательности функции фильтрации, характерной для почечных гломерул. Наконец, через 10-18 мес в моче преобладает нативный сывороточный альбумин, а также появляются сывороточные трансферрин и липопротеиды, что свидетельствует о дальнейшем усугублении нарушений фильтрационной функции почек. Через 20-22 мес после введения торотраста моча крыс приближается по составу белков к сыворотке крови. В этот период регистрируется гибель затравленных животных. Таким образом, ежемесячное исследование спектра белков мочи крыс после введения торотраста позволяет зарегистрировать последовательное проявление нарушений реабсорбционной, экскреторной и фильтрационной функций почек.
Двуокись тория, а-излучение, антигены, сывороточные белки, "собственно мочевые" белки, ка-нальцевая протеинурия, экскреция, альбумин, проксимальные канальцы, липопротеиды.
Торотраст широко использовался в качестве рентгеноконтрастного препарата в диагностических целях. Однако уже в 50-е годы прошлого века были обнаружены разнообразные патологические последствия применения торотраста. В спектре излучения торотраста преобладает а-излучение (90%), но присутствует также в- (10%) и у-излуче-ние. Наиболее серьезным побочным патологическим эффектом торотраста явилось его канцерогенное действие [1]. Причиной поражения органов после введения торотраста признается продолжительное локальное действие а-излуче-ния, источником которого являются "горячие частицы" - отложения оксида тория, надолго (50 и более лет) задерживающегося в тканях [2]. Токсическое действие могут вызывать также ионы тяжелых металлов, присутствующие среди продуктов распада тория. К органам, в которых торотраст накапливается и при внутривенном введении, и тем более при ретроградной пиелоне-фрографии, относятся почки [3, 4]. В составе экскретируемой ими мочи присутствуют белки.
*Адресат для корреспонденции: 125284 Москва, ул. Поликарпова, 10/12, РМАПО МЗ СО РФ; кафедра иммунологии; тел.: (8-495) 945-80-32; e-mail: immapo@yandex.ru.
Белки попадают в мочу вследствие двух процессов - клубочковой фильтрации и канальцевой секреции. Поступление белков в мочу в результате процесса фильтрации белков крови ограничивается размером, формой и зарядом их молекул (отрицательный заряд служит препятствием для фильтрования белков). Реабсорбции в проксимальных канальцах подвергается 95-99% белков провизорной мочи. В то же время фильтрат пополняется экскретируемыми почечными белками [5].
Поскольку выведение белков из крови в мочу очевидным образом зависит от основных функций почки (фильтрации, реабсорбция и секреция), повышение концентрации уропротеинов, изменение их спектра может рассматриваться как показатель нарушения этих функций [6]. В зависимости от локализации поражения почек, вызвавших нарушение поступления белков в мочу и, независимо от этиологии заболевания, принято различать гломерулярную, канальцевую и смешанную протеинурии [5]. Основой клубочковой протеи-нурии является нарушение проницаемости (избирательности) базальных мембран гломерул, что характерно для различных форм гломерулоне-
707
5*
фрита. При этом через гломерулярный фильтр начинают проникать в мочу сначала белки средней молекулярной массы (40-90 кДа), включая нативный сывороточный альбумин, а затем по мере утраты избирательности фильтрации высокомолекулярные сывороточные белки крови (более 90 кДа), так что белки мочи приобретают полное сходство с составом белков сыворотки крови. Появление в моче дополнительных низкомолекулярных фракций - сывороточных антигенов и сокращение экскреции почечных белков [5, 7] характеризует явление канальцевой протеи-нурии, которая обусловлена нарушением процесса избирательности реабсорбции белков в проксимальных канальцах [8]. При смешанной проте-инурии обнаруживаются и канальцевая, и гломерулярная недостаточность [5]. В работе [5] приводится подробный перечень заболеваний, при которых обнаруживаются канальцевая, смешанная и гломерулярная протеинурии. Отсюда следует, что помимо эндогенных патологических процессов, протеинурию вызывают экзогенные факторы - токсины, микробы, лекарственные препараты, тяжелые металлы и т.д. Одним из токсических агентов, нарушающих функции почек, может явиться торотраст. Описаны различные проявления почечной патологии, вызванной введением торотраста, вплоть до (как отмечалось выше) развития опухолей [10]. Однако в литературе отсутствуют данные, характеризующие во времени характер нарушения функции почек, вызванные воздействием торотраста, по изменению уровня содержания и состава уропротеинов. Наша работа восполняет этот пробел: она посвящена исследованию электрофоретических и имму-нохимических изменений состава белков мочи крыс в ежемесячной динамике после введения торотраста для выяснения, в какие месяцы и с какой последовательностью возникают протеинурии, какая из функций почек наиболее лабильна, какие изменения белков мочи свидетельствуют о необратимых нарушениях функции почек.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Работа выполнена на крысах-самцах линии "Август" весом 160-180 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Животных содержали на обычном водном и кормовом рационе. Крысам вводили однократно внутривенно 0.5 мл 25%-но-го коллоидного раствора двуокиси тория (торотраст). В качестве группы сравнения использовали интактных крыс соответствующего возраста. Периодически у наркотизированных подопытных животных брали пастеровской пипеткой кровь из ретроорбитального синуса; сыворотку получали общепринятым методом. Сбор мочи проводили в течение 2 сут [11]. Животных помещали в специальные клетки, оборудованные во-
ронкообразным устройством для стока мочи, к которому присоединяли специально сконструированную стеклянную воронку, позволяющую отделять мочу от твердых отходов. С целью консервирования к моче прибавляли мертиолат (1 : 50000). Мочу фильтровали, переносили в целлофановые мешочки, диализовали в течение 2 сут против дистиллированной воды и центрифугировали при 20000 g. После 10-15-кратного сгущения (упаривания) в токе холодного воздуха, создаваемого вентилятором, мочу диализовали против физиологического раствора с рН 7.2 и центрифугировали при 20000 g для удаления недиализующегося осадка. Все процедуры проводили при +2...+3°С. Концентрация белка в пробах мочи, использованных для дальнейшего анализа составляла 2530 мг/мл. Белок определяли по методу Lowry [12].
Для получения тканевых антигенов органы перфузировали через брюшную аорту холодным трис-НС1 буфером с сахарозой (0.25 моль/л сахарозы; 0.25 моль/л КС1; 0.005 моль/л MgC12; 0.35 моль/л трис-НС1 с рН 7.4).
Отмытые органы (почки, печень, селезенка, легкие, яички, соскоб слизистой кишечника) гомогенизировали при +2...+3°С в пяти объемах трис-буфера с сахарозой с рН 7.4 в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком при скорости вращения 2000-3000 об/мин. Полноту разрушения клеток контролировали фазовоконтраст-ной микроскопией мазков гомогената. После фильтрования через марлю гомогенат фракционировали методом дифференциального ультрацентрифугирования [13]. Клеточные органеллы (ядра, митохондрии, микросомы) отмывали и со-любилизировали 0.5%-ным раствором дезоксихо-лата натрия; экстракт отделяли от нелизирован-ных частиц центрифугированием, переносили в целлофановые мешочки и диализовали против забуференного физиологического раствора рН 7.4 для освобождения от реагента. Концентрацию белка в пробах доводили до 20-25 мг/мл.
Для получения преципитирующих иммунных сывороток каждому из 2-3 кроликов в области подколенных и шейных лимфоузлов, а также пальцевых фаланг лапы вводили внутрикожно соответствующие антигены (белки мочи, крови или субклеточные фракции органов) сначала в полном, а затем в неполном адьюванте Фрейнда. Через 5-7 сут после завершения иммунизации через разрез краевой вены уха или тотально из сонной артерии отбирали кровь, из сыворотки ее выделяли глобулиновую фракцию осаждением путем высаливания посредством 1/3 насыщения сульфатом аммония с последующим диализом против забуференного физиологического раствора с рН 7.2 до полного удаления ионов SO4. Ре-иммунизацию кроликов проводили через 1.5-2 мес посредством 1-2 внутрикожных и 2-3 внутримы-
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
709
шечных инъекций растворов, содержащих 1Q-15 мг антигена. Перекрестно реагирующие антитела удаляли из иммунных сывороток путем сорбции иммобилизованными белками сыворотки, мочи или тканевыми экстрактами различных органов под контролем реакции иммунопреципи-тации по Ouchterlony [14]. Идентификацию белков мочи на соответствие гранулярным структурам различных органов проводили по методике подслоения Osserman [15].
Электрофорез белков мочи в 1%-ном агаровом геле проводили по методу Grabar a. Williams [1б] в Q.Q5 моль/л мединаловом буфере с pH 8.2 в течение 12Q мин. Электрофореграммы фиксировали в течение 1Q-12 ч в 2.5%-ном растворе уксусной кислоты. После высушивания электрофореграммы окрашивали Q^^^b
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.