ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 10, с. 1066-1071
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОГЕННЫХ АМИНОВ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
© 2007 г. Л. А. Карцова*, А. А. Сидорова**, А. С. Иванова*
*Санкт-Петербургский государственный университет 198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 2 **000 ЦКП "Аналитическая спектрометрия" 195220 Санкт-Петербург, ул. Гжатская, 27, лит.А Поступила в редакцию 14.03.2006 г., после доработки 22.09.2006 г.
Показаны возможности электрофоретического разделения биогенных аминов (адреналин, норад-реналин, дофамин, серотонин, метанефрин, норметанефрин) в режимах капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии при введении в состав рабочего электролита комплексообразующих агентов (18-краун-6; 4,13-диаза-18-краун-6; ион-парного реагента додецилсульфата натрия) и ацетонитрила; отработана техника пробоподготовки биологических жидкостей (моча, сыворотка и плазма крови) с использованием твердофазной экстракции на оксиде алюминия и обращенно-фазовом сорбенте С18; выяснены возможности различных вариантов концентрирования биогенных аминов, позволившие снизить пределы их обнаружения в сотни раз.
Концентрации катехоламинов и их метаболитов в биологических объектах (моче, плазме и сыворотке крови, спинномозговой жидкости, структурах мозга) изменяются при различных кардиологических, нервных и психических заболеваниях [1]. В связи с тем, что содержание этих соединений в биологических жидкостях крайне мало (на уровне нг/мл), необходимы высокочувствительные методы их определения.
Используемый в данной работе метод капиллярного электрофореза (КЭ) характеризуется высокой эффективностью и обеспечивает разделение ионных и нейтральных веществ [2-6].
Однако чувствительность УФ-детектирования в режиме КЭ значительно уступает методу ВЭЖХ, что требует разработки новых вариантов концентрирования следовых количеств биологически активных соединений в процессе пробоподготовки и непосредственно в кварцевом капилляре [7-15].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Использовали системы капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ 105" (ООО "Люмэкс", г. Санкт-Петербург), "Agilent 1100 CE" (Hewllet Packard, USA).
Реагенты. Ацетонитрил (ос.ч., Криохром), вода бидистиллированная, уксусная кислота, три-этаноламин, додецилсульфат натрия (ДДСн, Merck, "GR for analysis"), 18-краун-6 (ТОО "НПК Реактив-Сервис"), 4,13-диаза-18-краун-6 (ТОО "НПК Реактив-Сервис"), этилацетат (х.ч. "Эк-рос"), оксид алюминия с рН поверхности <7 (Sig-
ma, for column chromatography, activity grade I, type WA-1), силикагель 60 (Merck, "for column chromatography" 15-40 мкм), сорбент С18; биогенные амины: адреналин (A), дофамин (DA), норадрена-лин (NA), серотонин (Ser), метанефрин (MN), норметанефрин (NMN) (Sigma).
Стандартные растворы биогенных аминов (1 г/л) готовили растворением точных навесок каждого амина (1 мг) в 1 мл 0.1 М раствора соляной кислоты в пробирках Эппендорфа и хранили при -12°C.
Отбор пробы мочи. Суточный объем мочи собирали в сосуд, охлаждаемый до +5°C, с 10 мл 6 М соляной кислоты. Все реальные объекты предварительно фильтровали через дисковый фильтр на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0.22 мкм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Электрофоретическое разделение биогенных аминов. На электрофоретические характеристики разделяемых компонентов влияют концентрация и рН буферного электролита, органические модификаторы и комплексообразующие агенты, введенные в состав рабочего буферного раствора. При оптимизации условий электрофоретического разделения катехоламинов и их метаболитов варьировали состав и рН рабочего буферного раствора (3-9.8); концентрацию органического растворителя - ацетонитрила (2-15%); концентрацию комплексообразующего агента (18-краун-6; 4,13-диаза-18-краун-6); содержание ион-парного реагента - додецилсульфата натрия (2-10 мМ). После серии предварительных экспериментов биогенные амины определяли в форме катионов
2
1
(а)
4 + 5 6 (б)
11
мин
12
11
12
13
Рис. 1. Электрофореграмма модельной смеси: дофамин (1), серотонин (2), норадреналин (3), норметанефрин (4), адреналин (5), метанефрин (6) 10 мг/л в 1 М уксусной кислоте; прибор: "Agilent 1100", X = 200 нм, Ьобщ = 60 см, ^эфф = 50 см, d = 50 мкм; ввод пробы: 50 мбар, 20 с; а) рабочий электролит: раствор 1%-ной уксусной кислоты и 30 мМ триэтанол-амин, рН 3.0; б) рабочий электролит: раствор 1%-ной уксусной кислоты, 10 мМ триэтаноламин, 10 мМ 18-краун-6.
1
3
4
6
3
мин
(рабочий электролит 1%-ный раствор уксусной кислоты). Для предотвращения адсорбции определяемых соединений на отрицательно заряженных стенках капилляра в рабочий буферный раствор вводили триэтаноламин (10 мМ).
Способность 18-краун-6 вступать в селективное комплексообразование с молекулами, содержащими протонированные аминогруппы, [16, 17] позволила полностью разделить пики дофамина и серотонина в условиях капиллярного электрофореза (рис. 1).
При этом значительно возросла эффективность определения дофамина (до 800 тыс. т. т.) и коэффициенты разделения (RS) пары дофамин/се-ротонин (с 0.5 до 4.9), которые рассчитывали по формуле:
12-1! RS = 2—-
w 1 + w 2
(1)
где t1, t2 - время выхода соседних пиков, с; w1, w2 -значения ширины пиков у основания.
Введение этого макроцикла в состав рабочего электролита значительно изменило электрофо-ретическую подвижность соединений с первичной аминогруппой (дофамин, норадреналин, серотонин, норметанефрин) и заметно не повлияло на вторичные амины - адреналин, метанефрин (рис. 2), что в этих условиях не позволило разделить адреналин (вторичный амин) и первичный амин норметанефрин (рис. 16).
В отличие от краун-эфира ион-парный реагент - додецилсульфат натрия (ДДСН) - изменяет электрофоретические характеристики первичных и вторичных аминов, образуя с ними гидрофобные ионные пары. Катехоламины и их метаболиты разделяются полностью (рис. 3 а).
С ростом концентрации ДДСН до 8 мМ наблюдается увеличение селективности разделения биогенных аминов, сопровождаемое снижением эффективности. Введение ацетонитрила (5%) в состав
ц, см2/кВ с 0.055
20 25 30 35 40 45 50 С(18-краун-6), мМ
Рис. 2. Графические зависимости эффективных элек-трофоретических подвижностей биогенных аминов от концентрации 18-краун-6 в буфере: 1%-ном растворе уксусной кислоты с добавкой 10 мМ триэтанол-амина: 1 - дофамин; 2 - серотонин; 3 - норадреналин; 4 - адреналин; 5 - метанефрин.
(а)
15 шЛи
10
(б)
13
Рис. 3. Электрофореграмма модельной смеси биогенных аминов: норадреналин (1), дофамин (2), норметанефрин (3), адреналин (4), метанефрин (5), серотонин (6); прибор: "Капель 105", Хмакс = 210 нм, Ьобщ = 60 см, Lэфф = 50 см, d = 50 мкм; а) рабочий электролит: 1% СН3СООН, 30 мМ ТЭА, 4 мМ ДДСН; б) рабочий электролит: 1% СН3СООН, 30 мМ ТЭА, 4 мМ ДДСН, 5% СН3С^
рабочего электролита позволило значительно повысить эффективность разделения (рис. 36) по сравнению с результатами, полученными при использовании только ион-парной добавки. Это можно объяснить как увеличением растворимости гидрофобных ассоциатов, так и изменением сольватационной оболочки разделяемых соединений, что увеличивает скорость их массообмена между ПАВ и рабочим электролитом.
Если концентрация ДДСН превышает критическую концентрацию мицеллообразования (>8.2 мМ), в растворе формируются мицеллы и реализуется режим мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). Использование ДДСН в качестве псевдостационарной фазы при разделении катехоламинов привело к неудовле-
N ТТ 180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Норадреналин □ Адреналин
0 2 4 6
[4, 13-диаза-18-к-6], мМ
Рис. 4. Влияние 4,13-диаза-18-краун-6 на эффективность разделения катехоламинов в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии.
творительному результату: отмечено достаточно сильное взаимодействие определяемых соединений с мицеллами.
Известно, что в нейтральной и щелочной среде в режиме ОФ ВЭЖХ 4,13-диаза-18-краун-6, введенный в состав подвижной фазы, обладает анионной селективностью и способен образовывать с разделяемыми веществами комплексы с участием водородных связей. Этот процесс реализован нами в условиях мицеллярной электрокинетической хроматографии (рабочий электролит - фосфатный буфер, рН 7.0).
Введение 18-членного диаза-макроцикла позволило увеличить разрешение компонентов, что сопровождалось ростом эффективности (рис. 4). Оптимальная концентрация макроцикла составила 4 мМ.
Значения пределов обнаружения биогенных аминов превысили 1000 мкг/л, что не позволяло их количественное определять в реальных биологических жидкостях. Поэтому были детально исследованы возможности различных вариантов концентрирования, в том числе т. н. стэкинг.
Описано несколько вариантов концентрирования компонентов пробы непосредственно в кварцевом капилляре [7-15], из которых применительно к биогенным аминам и их метаболитам в данной работе изучены следующие: "водная пробка"; стэкинг с усилением поля; электростэкинг; концентрирование с большим вводом пробы.
Первый вариант - основан на различии в элек-тропроводностях раствора пробы и буферного электролита (стэкинг с усилением поля) (рис. 5) [9, 11]. Компоненты пробы растворяли в воде и вводили образец, подлежащий анализу, в виде
2
1
1
3
4
5
6
7
8
8
Рис. 5. Схематическое изображение стэкинга. £ - образец, растворенный в воде, I I - область низ-копроводящей матрицы, I I - область высокопрово-дящей матрицы.
водного раствора. На границе двух растворов с различной электропроводностью - раствора про-
бы и буферного электролита - концентрировались определяемые вещества (табл. 1).
Второй вариант - использование "водной пробки". Компоненты пробы растворяли в буферном растворе. Перед введением пробы в кварцевый капилляр вводили небольшой объем дистиллированной воды. При этом варьировали время ввода (4-15 с) и давление (25-30 мбар).
Третий - большой ввод раствора пробы. Зону пробы вводили давлением 30 мбар 5-120 с. Компоненты пробы растворяли в подкисленном водном растворе. Этим способом удалось до
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.