БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 2, с. 110-118
УДК 577.352
ЭЛЕКТРОГЕННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ИОНОВ С ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ
СТОРОНЫ Na+,K+,ATP-a3bi
© 2015 г. В. Ю. Ташкин1, А. Н. Гаврильчик1, А. И. Иловайский2, Х.-Ю. Апель3, В. С. Соколов1*
Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119991, Москва,
Ленинский просп., 31, Россия; *электронная почта: sokolovvs@mail.ru 2Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва 3Биологический факультет Университета г. Констанц, 78457Констанц, Германия
Поступила в редакцию 11.11.2014 г.
Изучено электрогенное связывание ионов натрия, калия и протонов в сайтах с цитоплазматической стороны №+,К+,АТР-азы с помощью измерений приращений емкости и проводимости (адмиттан-са) при скачках рН и концентрации ионов натрия в отсутствие АТР. Скачки рН создавались на бис-лойной липидной мембране (БЛМ) с адсорбированными на ней фрагментами мембран, содержащих №+,К+,АТР-азу, при быстром освобождении кислоты из связанного состояния (Caged-H+) под действием вспышки ультрафиолетового света. Скачки концентрации ионов натрия создавались с помощью быстрой смены растворов в экспериментах, где вместо бислойной липидной мембраны использовался золотой электрод, покрытый монослоями тиолов и фосфолипидов. Изменение емкости мембраны, вызванное закислением среды при фотолизе Caged-H+, зависело от концентрации ионов натрия. Аналогичный эффект имели ионы калия. Полученные результаты объяснялись моделью конкурентного связывания протонов с ионами натрия и калия. Аппроксимация зависимости изменения емкости от концентрации ионов натрия теоретическими кривыми позволила определить константу диссоциации Kи коэффициент кооперативности n связывания ионов натрия (K = 2.7 мМ, n = 2) и калия (K = 1.7 мМ, n = 2). Похожее значение константы диссоциации для ионов натрия (2.5 мМ) получено в экспериментах с быстрой сменой раствора на золотом электроде, определенное по положению максимума колоколообразной зависимости изменения емкости от концентрации ионов натрия. В присутствии ионов магния кажущиеся константы диссоциации ионов натрия возрастали. Вероятно, эффект ионов магния вызван их связыванием с белком, что ингибирует связывание с ним ионов натрия, влияя на конформацию белка, либо на электростатический потенциал в сайтах связывания.
Ключевые слова: натриевый насос, электрогенный транспорт, №+,К+,АТР-аза, Caged-H+, мембраны на твердой подложке.
DOI: 10.7868/S0233475515020103
№+,К+,АТР-аза — один из наиболее распространенных белков семейства Р-АТР-аз, который переносит из клетки ионы натрия, а в клетку — ионы калия за счет энергии гидролиза молекулы АТР. Механизм этого активного транспорта включает в себя изменение конформации №+,К+,АТР-азы, из-за чего поочередно открывается доступ ионов к центрам связывания в белке из растворов либо с цитоплазматической (эта конформация обозначена E1), либо с внеклеточной (конформация E2) сторон мембраны [1, 2]. Существенным шагом к выяснению механизма функционирования №+,К+,АТР-азы было получение структуры белка в этих двух основных конформациях [3—6]. Однако для выяснения детального механизма активного транспорта необходимы количественные измерения его ки-
нетических и равновесных параметров, а также изучение влияния на них внешних факторов. Несмотря на интенсивные исследования, проводившиеся в течение нескольких десятков лет, все еще остается множество вопросов, связанных с механизмом его функционирования. Наименее изучено строение канала, связывающего центры связывания с раствором с цитоплазматической стороны белка. В последнее время показано, что №+,К+,АТР-аза может переносить не только ионы натрия и калия, но и протоны, но механизм такого транспорта и его роль выяснены не до конца [7—11].
Как показано в ряде исследований, связывание ионов с цитоплазматической стороны Ма+,К+,АТР-азы представляет собой электрогенный процесс. На него влияет приложенное к мем-
бране напряжение, а перемещение ионов к центрам связывания вызывает появление электрического тока [12—14]. С помощью флуоресцентных зондов установлено, что с цитоплазматической стороны белка могут связываться не только ионы натрия и калия, но и протоны, причем между ионами натрия и калия с одной стороны и протонами — с другой имеется конкуренция за места связывания [7, 15, 16]. Показано также, что константа связывания Na+ в цитоплазматических сайтах зависит от концентрации Mg2+ [15—18]. Это говорит о том, что ионы магния могут служить не только кофактором гидролиза ATP, но и влиять на связывание ионов, причем механизм такого влияния неизвестен.
Конкурентное связывание протонов и ионов натрия изучалось нами ранее на модельной системе, в которой мембранные фрагменты (МФ), содержащие №+,К+,АТР-азу, адсорбировались на поверхности бислойной липидной мембраны (БЛМ). В исследованиях измерялись малые приращения емкости мембраны с №+,К+,АТР-азой, вызванные быстрым закислением среды с помощью фотолиза Caged-H+ [19]. Изучение зависимости этого сигнала от рН при разных концентрациях ионов натрия позволило определить рК протониро-вания центров связывания. Однако точность измерений была ограничена, что не позволило определить константы связывания ионов натрия, а также изучить возможность конкурентного связывания с протонами ионов калия.
Измерения электрических сигналов при быстром изменении концентрации ионов натрия можно проводить и с помощью методов, основанных на быстрой смене раствора. Эксперименты со сменой раствора проводят на более устойчивой системе, чем БЛМ — на золотом электроде, покрытом слоями тиолов и фосфолипидов [20]. Обнаружены переходные токи, вызванные изменением концентрации ионов натрия [14, 21]. Эти токи наблюдали и в присутствии, и в отсутствие АТР. В последнем случае эти сигналы были связаны с перемещением ионов натрия во внутриклеточном канале №+,К+,АТР-азы.
В настоящей работе в результате детальных измерений приращений адмиттанса, вызванных быстрым изменением рН с помощью фотолиза Caged-H+, а также изменением концентрации ионов натрия с помощью быстрой смены раствора удалось определить значения констант связывания ионов натрия и калия с цитоплазматиче-ской стороны №+,К+,АТР-азы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
БЛМ формировали по методу Мюллера-Руди-на в тефлоновой ячейке на отверстии диаметром 1 мм из дифитаноиллецитина (АуапИ Ро1аг Lipids,
США), растворенного в н-декане. Раствор, применявшийся для исследования Na+,K+,ATP-a3bi, содержал NaCl, концентрация которого варьировалась (см. подписи к рисункам), 0.1 мМ EDTA (acid) и 12 мМ хлорида N-метил-^-глюкамина (NMG) (Sigma, США). Хлорид NMG был необходим для функционирования хлорсеребряных электродов в отсутствие NaCl. Для приготовления растворов использовали NaCl, MgCl2 (Merck, Германия), EPPS (Sigma, США), дитиотреитол (Sigma, США). Все растворы готовили на дистиллированной воде, дополнительно очищенной с помощью MILI-Q50 c фильтром Pure PACK-1 (Thermo Scientific). В экспериментах с Caged-H+ использовали 2-метокси-5-нитрофенилсульфат натрия (MNPS-Na), синтезированный в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН.
Фрагменты мембран, содержащие очищенную ^^К^А^-азу в концентрации около 2 мг/мл, были выделены из почек кролика по процедуре [22]. Активность Na^K^ATP^bi при 37°C составляла 1300—1700 мкM неорганического фосфата в час на мг белка. Суспензию фрагментов с Na+,K+,ATP-азой хранили при —60°C в течение нескольких месяцев без существенной потери активности. При проведении измерений суспензию размораживали и хранили при +4°C не более 2 нед.
Приращения емкости и проводимости БЛМ с адсорбированными на ней фрагментами мембран с Na+,K+,ATP-азой, вызванные фотолизом Caged-H+, измеряли с помощью методики, описанной в [19]. Во всех опытах суспензию фрагментов мембран с Na+,K+,ATP-азой (в концентрации 20 мкг/мл) и Caged-H+ (300 мкМ) добавляли в дальний (по отношению к свету) отсек. БЛМ освещали ксеноновой лампой-вспышкой с сапфировым окном FJ-249 (EG&G, США). Адсорбция фрагментов мембран с Na+,K+,ATP-азой происходила в течение примерно 1 ч и контролировалась по уменьшению суммарной емкости БЛМ. Относительные приращения емкости усредняли по экспериментам на нескольких БЛМ (не менее трех).
Приращения емкости и проводимости, вызванные быстрым изменением концентрации ионов натрия, измеряли на электроде, состоящем из слоя алкантиолов, ковалентно связанных с золотой поверхностью посредством сульфидных групп, и фосфолипидного монослоя на этом слое (рис. 1а). В качестве золотой поверхности использовали проволоку прямоугольного сечения 0.05 х 0.127 мм (Biomund Cohn Corp. Mt Mt Vfeanon, США, чистота 99.99%). Проволоку предварительно очищали. Сначала ее погружали в спирт и выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 10 мин, а затем в течение 20 с в смеси серной кислоты и перекиси водорода (25% H2O2, 75% H2SO4), после чего промывали дистиллированной водой. Остаток воды удаляли
Рис. 1. а — Строение покрытия золотого электрода: 1 — золотой электрод, 2 — монослой гексадекантиолов, 3 — монослой липидов, 4 — мембранный фрагмент с №+,К+,АТР-азой. б — Схема ячейки для смены растворов.
промывкой ацетоном с последующей сушкой под аргоном. Чистую проволоку сразу помещали в 10 мМ раствор гексадекантиола (Sigma-Aldrich, США) в гексане и оставляли в нем на ночь при комнатной температуре. Непосредственно перед проведением эксперимента проволоку помещали на 2 мин в гексан. Для фиксации площади рабочей поверхности проволоки во время эксперимента всю остальную поверхность покрывали лаком. После измерения емкости тиольного покрытия электрод опускали в раствор дифитаноилфосфатидилхолина (Avanti Polar Lipids, США) в декане в концентрации
15 мг/мл на 3 мин, а затем сразу помещали в рабочий раствор, где растекание липида и формирование монослоя на поверхности электрода наблюдали по изменению его емкости (емкость уменьшалась примерно в 2 раза). После формирования монослоя липидов в ячейку добавляли суспензию фрагментов мембран с Ма+,К+-АТР-азой, адсорбция которых продолжалась около 1 ч, и измерения проводили после того, как значение емкости БЛМ достигало стациона
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.