ФИЗИКОХИМИЯ ПОВЕРХНОСТИ И ЗАЩИТА МАТЕРИАЛОВ, 2015, том 51, № 2, с. 213-216
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СИСТЕМ
УДК 543.253
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ
АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЫ КРОВИ НА СТЕКЛОУГЛЕРОДЕ, МОДИФИЦИРОВАННОМ ГЕКСАЦИАНОФЕРРАТОМ КОБАЛЬТА
© 2015 г. А. К. Евсеев1, В. Н. Андреев2, Е. С. Кондратьева3, М. М. Гольдин1
1ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ, 129090, Москва, Б. Сухаревская пл., 3 e-mail: anatolevseev@gmail.com 2Институт физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН,
119071, Москва, Ленинский просп., 31 3Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125047, Москва, Миусская пл., 9 Поступила в редакцию 19.06.2013 г.
Разработан метод определения антиоксидантной активности плазмы крови на стеклоуглеродных электродах, модифицированных гексацианоферратом кобальта. Получена линейная зависимость тока от концентрации антиоксидантов в диапазоне 2.5 х 10-4—2.5 х 10-1 г/л. Показано, что величины антиоксидантной активности образцов плазмы крови практически здоровых добровольцев совпадают с литературными данными.
DOI: 10.7868/S0044185615020059
ВЕДЕНИЕ
Проблеме диагностики нарушений окислительно-восстановительного баланса организма человека посвящено значительное количество работ [1]. Этот интерес связан с тем, что нарушение баланса между про- и антиоксидантами при острых заболеваниях различной этиологии может приводить к нарушениям процессов очищения внутренней среды организма от продуктов распада в результате протекания окислительных стрессов либо торможения радикальных процессов [2, 3]. Среди прооксидантов наиболее широкую группу представляют активные формы кислорода (АФК). Известно, что молекулярный кислород обычно не участвует в неконтролируемых процессах, протекающих в организме, и не подвергает опасности органические макромолекулы клетки. Главными
АФК являются супероксидные радикалы (О--), перекись водорода (Н2О2), гидропероксидный
радикал (НО 2) и гидроксильный радикал (НО'),
синглетные формы кислорода (1О2), ионы НО- и гипохлорная кислота (НС1О) [4, 5]. Основные механизмы появления АФК в организме связаны обычно с нарушениями функционирования элек-троннотранспортных цепей митохондрий или микросом. Также АФК играют важную роль в протекании различных процессов, в защитных иммунных механизмах организма.
Важнейшими элементами антиоксидантной защиты организма являются такие ферменты, как су-пероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, классические антиоксиданты — аскорбиновая кислота, витамин Е, витамин А и каротиноиды. Указанные вещества активны почти ко всем АФК, но их вклад в общую антиоксидантную активность организма не слишком велик [6].
Количественный анализ АФК связан с малым временем жизни активных радикалов [7], поэтому их детектирование обычно производят по продуктам метаболизма АФК (например, малоновому диальдегиду), что требует использования трудоемкого и длительного анализа [8].
Наиболее перспективным выглядит оценка и контроль антиоксидантной системы организма. В настоящее время разработан ряд методов определения антиоксидантной активности организма [9] в том числе с помощью биосенсоров [10]. Особое внимание уделяется электрохимическим сенсорам, благодаря чувствительности, селективности и простоте анализа. В рамках данного направления выделим сенсоры на основе гексацианоферратов переходных металлов, в частности, гексацианофер-ратов кобальта (СоНСБ) [11], которые являются активными как по отношению к прооксидантам, так и к антиоксидантам, что расширяет возможности их применения для мониторинга состояния организма.
214
ЕВСЕЕВ и др.
Целью настоящей работы является разработка электрохимической методики определения суммы антиоксидантов в плазме крови на стеклоуг-лероде, модифицированном гексацианоферра-том кобальта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве подложки рабочего электрода использован стеклоуглеродный стержень, площадь торца которого составляла 2 мм2. Стержень обрабатывали шлифовальной бумагой N6, затем промывали дистиллированной водой и высушивали. Гексацианоферрат кобальта СоИСБ осаждали электрохимически в виде пленки из раствора состава 0.15 М ШС1 (х.ч., ООО "Баум-люкс"), 1 мМ К3[Бе(С^6] (ч., ООО "ТД "Химмед") и 1 мМ Со804 • 6И20 (ООО "ТД "Химмед"). Для электроосаждения использовали циклическую развертку потенциала в диапазоне от —400 до +1100 мВ (х.с.э.), количество циклов составляло 35, скорость развертки потенциала — 25 мВ/с (рис. 1). Использован потенциостат 1РС-Сошрае1 (НПФ "Вольта").
После осаждения проводилось тестирование электрода в растворе 0.15 М №С1 в качестве фонового электролита с помощью циклической развертки потенциала в диапазоне от —400 до +1000 мВ (х.с.э.) в течение 10-ти циклов при скорости развертки потенциала 250 мВ/с.
После каждого измерения в тестируемом растворе антиоксиданта производилась указанная обработка электрода в течение 5-ти циклов. Указанная обработка использовалась для очистки поверхности электрода и возвращения химического состава активного слоя (гексацианоферрата кобальта) в первоначальное состояние.
Растворы антиоксидантов в диапазоне концентраций 2.5 х 10-4—2.5 х 10-1 г/л готовили в 0.15 М
растворе NaCl, в качестве модельного антиоксидан-та использовали препарат Аскорутин (ООО "Роз-фарм"), содержащий 15% рутина и 15% аскорбиновой кислоты.
Плазму крови получали центрифугированием цельной крови 15-ти практически здоровых добровольцев на центрифуге CR-3.12 (Jouan), режим центрифугирования — 1500 g, время центрифугирования — 15 мин. Перед измерением плазма смешивались с фоновым электролитом в соотношении 1 : 10.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что процесс электроосаждения гек-сацианоферратов переходных металлов в большинстве случаев протекает в несколько стадий [12]. В случае электроосаждения гексацианоферрата кобальта предлагается механизм [13]:
3Co2+ + 2[FeIII(CN)6]3+ ^ Co" [Fein(CN)6]2, (1) CoI3I[FeIII(CN)6]2 + K+ + e ^ KCo^Fe^CN)^, (2)
KCo"[FeII(CN)6]2 + K+ + e ^ K2CoII[FeII(CN)6].(3)
Активность модифицированного электрода по отношению к Аскорутину была протестирована на модельных растворах. Как видно из данных, представленных на рис. 2, по мере увеличения концентрации аскорутина в анализируемом растворе происходит снижение сигнала отклика. Оказалось также, что при концентрации Аскору-тина 2.5 х 10-1 г/л на циклической вольтамперо-грамме появляется пик в области потенциалов около +600 мВ.
Однако оказалось, что после проведения измерений концентрации Аскорутина имеет место постепенное уменьшение сигнала отклика в фоновом электролите. Вероятно, это может быть свя-
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
215
0.5 0.5
1Б с
Рис. 3. Зависимость А/ от концентрации Аскорутина при Е = 600 мВ.
зано с необратимым взаимодействием активной композиции на электроде с модельным раствором Аскорутина, то есть имеет место постепенное уменьшение активности гексацианоферрата.
Этот эффект был учтен при построении калибровочных кривых антиоксидантов: для каждой концентрации антиоксиданта рассчитывалась разница между током в фоновом и модельном растворе (А/) при потенциале +600 мВ. На основании этих данных строилась калибровочная кривая в координатах А/ = /(1§ с). Таким образом, каждая последующая концентрация Аскорутина отсчитывалась от нового состояния поверхности электрода. Как видно из калибровочного графика (рис. 3), с увеличением концентрации антиокси-дантов происходит увеличение А/ между фоновым и модельным раствором. Эти данные показывают, что активность пленки по отношению к антиоксидантам все же достаточно хорошо сохраняется, поэтому зависимость А/ от концентрации антиоксиданта является линейной.
Представленные на рис. 3 данные позволили получить следующее уравнение калибровочной кривой:
А/ = 0.12181ё(с) + 0.4124. (4)
Дальнейшее преобразование данного уравнения привело к выражению для расчета общей ан-тиоксидантной активности анализируемой среды. Для увеличения объема исследуемого раствора было решено разбавлять плазму крови фоновым раствором в соотношении 1 : 10, в связи в этим в уравнение был введен поправочный коэффициент.
с = 10((Д/- 0.4124)/0.1218) х 10, (5)
где с — общая антиоксидантная активность плазмы в пересчете на Аскорутин, г/л; А/ — изменение отклика по току, мА; 10 — коэффициент, учитывающий разбавление.
и
£
о о Я <ч
15-
м
се «
св £
Й о
И <
о о о &
15
я
св «
св
я
ю
О
0.04 0.03 0.02 0.01
А А
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
№ добровольца
Рис. 4. Антиоксидантная активность 15-ти практически здоровых людей.
При исследовании плазмы крови 15-ти практически здоровых людей был получен коридор значений в диапазоне концентраций 5.54 х 10—3—3.78 х 10—2 г/л (рис. 4).
Из литературных данных [14] известно, что концентрация аскорбиновой кислоты, определенная колориметрическим методом, в плазме крови находится в диапазоне от 1 х 10—3—2 х 10—2 г/л, то есть полученные данные вполне соответствуют полученному диапазону концентраций.
Таким образом, предложенный в настоящей работе стеклоуглеродный электрод, модифицированный гексацианоферратом кобальта, имеет перспективы для использования его в медицинской практике.
ВЫВОДЫ
1. Разработана методика модифицирования стеклоуглеродного электрода гексацианоферра-том кобальта, обладающего электрохимической активностью по отношению к антиоксидантам.
2. Разработана методика определения антиок-сидантной активности плазмы крови относительно Аскорутина на стеклоуглеродных электродах, модифицированных гексацианоферратом кобальта.
3. Получена корреляция диапазона концентраций антиоксидантов плазмы крови практически здоровых добровольцев, измеренного с помощью стеклоуглеродного электрода, модифицированного гексацианоферратом кобальта, с литературными данными для указанного диапазона, определенного колориметрическим методом.
Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 14-29-00194).
216
ЕВСЕЕВ и др.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sen C.K., Packer L, Hanninen O.O.P. Handbook of Oxidants and Antioxidants in Exercise. Amsterdam: Elsevier Sci., 2000. 1220 p.
2. Sin
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.