БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 3, с. 230-238
УДК 577.352.26
ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПРИ АДСОРБЦИИ И ДЕСОРБЦИИ ПОЛИЛИЗИНОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН РАЗНОГО СОСТАВА
© 2008 г. О. А. Финогенова, Д. В. Филинский, Ю. А. Ермаков
Институт физической химии и электрохимии им. АН. Фрумкина РАН, 119991 Москва, Ленинский проспект, 31; электронная почта: yermakov@elchem.ac.ru
Поступила в редакцию 17.12.2007 г.
Проведены электрокинетические измерения в суспензии липосом из смесей заряженного (кардио-липин, CL) и нейтрального (фосфатидилхолин, PC) липидов в присутствии лизина и полипептидов на его основе. Ни монолизин, ни полилизины не адсорбируются на нейтральных мембранах (PC). В случае отрицательно заряженных мембран (CL/PC) все поликатионы демонстрируют крутую зависимость электрофоретической подвижности от количества добавленного в ячейку полимера. В суспензии липосом из кардиолипина положение точки нулевого заряда совпадает для всех высокомолекулярных полилизинов, при этом пентализин нейтрализует поверхность мембран, тогда как поликатионы с более высокой степенью полимеризации меняют знак заряда поверхности. Электрофоретическая подвижность липосом в области плато зависит от молекулярного веса полилизинов и состава липосом и для крупных макромолекул по абсолютной величине приближается к ее значению для исходных липосом. Адсорбция поликатионов на плоских бислойных липидных мембранах (БЛМ) приводит к изменению граничного потенциала, измеренного методом компенсации внутримембранного поля (КВП). Электрокинетические измерения и метод КВП дают близкие результаты в случае мономеров лизина, и их концентрация на поверхности хорошо описывается изотермой распределения молекул между поверхностью мембраны и раствором. Существенное различие поверхностного и граничного потенциалов, обнаруженное в случае пентализина, отражает изменение дипольной компоненты граничного потенциала, вызванное адсорбированными молекулами. Методом КВП зарегистрирован процесс адсорбции полилизинов вдали от насыщения, кинетика которого существенно более медленная (более часа), чем в случае пентализина (десятки минут) и монолизина (минуты). Перфузия ячейки фоновым электролитом показывает, что в отличие от пента- и монолизина адсорбция высокомолекулярных полилизинов на плоских БЛМ практически необратима.
Целенаправленный синтез полимеров биомедицинского назначения подразумевает использование детальных сведений о механизме их взаимодействия с клеточными мембранами. Достаточно очевидно, что мембраноактивные свойства, кинетика адсорбции и встраивания таких полимеров в биомембраны зависят не только от химической структуры и конформации макромолекул, но и от липидного состава мембран и, прежде всего, от наличия заряженных групп в полярной головке фос-фолипидов. Важные сведения о влиянии полимеров на структуру клеточных мембран могут быть получены на их известных липидных моделях - ли-посомах и плоских БЛМ. Поскольку большой класс биологически значимых полимеров представлен поликатионами, а клеточные мембраны содержат отрицательно заряженные компоненты, особый интерес представляет изучение электростатических эффектов. В данной работе такое исследование проведено на синтетических полипептидах с разной длиной молекулярной цепи, каждое из звеньев которой представляет собой аминокислоту лизин, несущую в обычных условиях положительный заряд.
Выбор полилизинов для исследования обусловлен их широким использованием в биомедицинской практике при формировании различного рода наногранул в комбинации с отрицательно заряженными макромолекулами и ДНК, а также как вспомогательного материала для компенсации отрицательного заряда различных поверхностей (см., например, [1-4]). Однако более важным мотивом для изучения электростатических эффектов с применением липидных моделей клеточных мембран является тот факт, что на основе полилизинов синтезируются многие препараты, обладающие иммуноактивными свойствами, в частности плюроники, имеющие определенные перспективы при лечении раковых заболеваний [5]. Сравнительно недавно в ряде работ было показано [6, 7] и подтверждено нашими исследованиями [8], что в основе биологической активности подобных препаратов лежит их адсорбция на поверхности клеточных мембран и участие в транспортных процессах. Более того, хорошо известны природные белки, у которых имеется аминокислотная последовательность гомологичная пентализину, играющая важную роль при связывании этих белков с
Использованные в работе реактивы и их параметры по каталогу фирмы "Sigma" (США)
Обозначение Название Количество звеньев Молекулярная масса (по вязкости) Номер по каталогу
Lys L-Лизин и D-лизин моногидрохлорид 1 182.65 L-8662
Lys-5 Пентализин 5 658.9 L-9151
Lys-12 Поли-0-лизин гидробромид 12 2500 P-0296
Lys-130 » 130 27200 P-4408
Lys-211 » 211 44100 P-7886
Lys-598 » 598 125100 P-0899
Lys-1435 » 1435 300000 P-1149
клеткой [9]. Не случайно поэтому, что адсорбция пентализина на мембранах разного липидного состава была подробно изучена, в том числе и электрокинетическими методами [10, 11]. Однако мы не нашли сведений о подобном исследовании поли-лизинов с более высокой степенью полимеризации, которые особенно интересны тем, что могут не только нейтрализовать, но и менять знак заряда поверхности мембран.
Некоторые данные об адсорбции поликатионов на липидных мембранах смешанного состава содержатся в предыдущих наших работах с синтетическими полимерами [12, 13]. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии было показано, что их адсорбция сопровождается сегрегацией липидов в латеральном направлении [14, 15]. В ранних исследованиях методом компенсации внутримембранного поля (КВП) с применением непрерывной перфузии были обнаружены эффекты, свидетельствующие о частично необратимом связывании крупных макромолекул с поверхностью мембран [12]. Высокая эффективность адсорбции поликатионов подобна адсорбции многовалентных катионов, константа связывания которых чрезвычайно велика [16, 17]. Определенный интерес поэтому представляет сравнение экспериментальных данных для поликатионов с расчетами, выполненными на основе разработанной нами модели адсорбции многовалентных катионов. Есть основания также полагать, что в обоих случаях адсорбция сопровождается и изменениями в упаковке липидов в мембране.
В данной работе мы сконцентрировали внимание на изучении электростатических эффектов, вызванных адсорбцией на липидных мембранах полилизинов разного молекулярного веса. С этой целью использованы два взаимодополняющих метода - регистрация электрокинетической подвижности в суспензии липосом и разработанный в лаборатории метод контроля изменений в распределении электрического поля на границах бислоя с помощью компенсации внутримембранного поля [13, 18]. Последний метод позволяет оценить изменения граничного потенциала, которые включают в себя как поверхностную, так и дипольную компоненту. Сравнение результатов двух методов поз-
воляет сделать определенные выводы об изменениях дипольного потенциала, которые отражают переориентацию дипольных моментов в области полярных головок фосфолипидов, если она инициирована адсорбированными на поверхности макромолекулами. Метод КВП позволяет также регистрировать непосредственно кинетику адсорбции и десорбции различных веществ на поверхности мембраны при дробном или непрерывном добавлении их в ячейку и при последующей замене раствора непрерывной перфузией фоновым электролитом. Этот метод уже был нами использован ранее при изучении кинетики связывания с мембраной синтетических полимеров поликонидина [12] и многовалентных катионов гадолиния [16]. Мы используем этот метод здесь для сравнения кинетики адсорбции и десорбции макромолекул одинаковой химической природы, но разного молекулярного веса.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для приготовления липосом и формирования БЛМ использовали следующие липиды: кардиоли-пин-стандарт, спиртовый раствор 0.5% (Харьков, Украина) и лиофилизованные фосфолипиды ("Sigma", США): кардиолипин из бычьего сердца (натриевая соль) и яичный лецитин. Во всех образцах кар-диолипина хроматографически обнаруживалась некоторая неоднородность состава, однако разделить и идентифицировать компоненты нам не удалось. Лиофилизованные липиды предварительно растворяли в хлороформе ("Aldrich", США). Для приготовления липосом растворы высушивали в кругло-донной колбе под вакуумом в роторном испарителе около 30 мин, затем интенсивно встряхивали в присутствии фонового электролита (10 мМ KCl) до образования суспензии с концентрацией липида в образце 1 мг/мл. Для формирования БЛМ использовали растворы липидов в декане с концентрацией 15 мг/мл. Использованные в работе полилизины перечислены в таблице вместе с данными о длине макромолекул по каталогу компании "Sigma".
Экспериментальная ячейка позволяла непрерывно контролировать электропроводность образца, которая практически не менялась при добавлении полилизинов вплоть до их максимальной
Потенциал, мВ 0
0 20 40 60 80 100 Содержание кардиолипина, %
Рис. 1. Дзета-потенциал, измеренный в суспензии ли-посом с разным содержанием кардиолипина в смеси с фосфатидилхолином в фоновом электролите 10 мМ KCl. Теоретическая кривая построена с учетом адсорбции ионов калия на отрицательно заряженных молекулах кардиолипина с константой Ki = 1 М-1 и Smax = -150 мКл м-2.
концентрации в суспензии. Их присутствие не влияло на рН растворов, а контрольные измерения в буферном растворе не обнаружили влияния буфера на результаты измерения. По этой причине основные измерения были проведены в отсутствие буфера при температуре 22°С. Средний размер мультислойных липосом (около 1 мкм) и их элек-трофоретическую подвижность измеряли методом динамического светорассеяния с применением оптической системы регистрации лазерного излучения прибора Zetasizer II ("Malvern Instr.", Великобритания). Измерение и первичная обработка автокорреляционной кривой осуществлялась коррелятором PhotoCor-SP (США). Расчет спектра электрофоретической подвижности проводился с помощью программы, разработанной авторами на основе алгоритма, и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.