УДК 577.352.2
ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ЗАМЕЩЕННЫХ МЕТАЛЛОФТАЛОЦИАНИНОВ
С КЛЕТКАМИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ: РОЛЬ В ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ*
© 2009 г. М.Г. Страховская1**, Ю.Н. Антоненко2, А.А. Пашковская2,3, Е.А. Котова2, В. Киреев1,6, В.Г. Жуховицкий4, Н.А. Кузнецова5, О.А. Южакова5, В.М. Негримовский5, А.Б. Рубин1
1 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1; факс: (495)939-1115, электронная почта: marstr@biophys.msu.ru
2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1; факс: (495)939-3181, электронная почта: antonen@genebee.msu.ru
3 Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, 1; электронная почта: PashkovskaiaAA@yandex.ru
4 Городская клиническая больница им. С.П. Боткина, 125101 Москва, 2-й Боткинский пр., 5
5 НИИ органических полупродуктов и красителей (ФГУП ГНЦ «НИОПИК»), 123995 Москва, ул. Б. Садовая, 1/4; факс: (495)254-7015, электронная почта: lab32@niopik.ru
6 Факультет естественных наук Вильнюсского университета, ул. Чурлениса, 21/27, LT-03101 Вильнюс, Литва
Поступила в редакцию 25.02.09 После доработки 20.05.09
Исследовано влияние ионных заместителей в молекулах фталоцианинов цинка и алюминия и поверхностного заряда мембран на взаимодействие красителей с искусственными мембранами и клетками энтеробак-терий и эффективность фотосенсибилизации. Показано, что с увеличением количества положительно заряженных заместителей степень связывания фталоцианиновых красителей с клетками Escherichia coli возрастает. Это, наряду с высоким квантовым выходом генерации синглетного кислорода, определяет эффективную фотодинамическую инактивацию грамотрицательных бактерий октакатионными фталоцианинами цинка и алюминия. Изучено влияние катионов Ca2+ и Mg2+, а также рН на фотодинамическую инактивацию энтеробактерий в присутствии октакатионного фталоцианина цинка. Установлено, что воздействия, приводящие к снижению отрицательного заряда наружной мембраны, защищают бактерии от фотоинактивации, что подтверждает определяющую роль электростатического взаимодействия фотосенсибилизатора с клеточной стенкой в этом процессе. Электростатическая природа связывания согласуется с преимущественно электростатическим характером взаимодействия красителей с искусственными мембранами различного состава. Отмечена пониженная чувствительность к фотодинамической инактивации Proteus mirabilis по сравнению с E. coli и Salmonella enteritidis, связанная со слабым сродством катионного красителя к клеткам этого вида.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фотодинамическая инактивация, фотосенсибилизатор, фталоцианины, энтеробак-терии, липополисахариды, тушение флуоресценции, флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS).
Принятые сокращения: БЛМ — бислойная липидная мембрана, ЛПС — липополисахариды, КОЕ — колониеобра-зующие единицы, ФДИ — фотодинамическая инактивация, Фд — квантовый выход генерации синглетного кислорода, ZnPcPym4+, AlPcPym4+, ZnPcPym8+, AlPcPym8+ — тетракис- и октакис(пиридиниометил)фталоцианины цинка и хлоралю-миния, ZnPcChol8+ — октакис(холинил)фталоцианин цинка, AlPc3- — трижды сульфированный фталоцианин алюминия — фотосенс, AlPc4- — четырежды сульфированный фталоцианин алюминия, ZnPc4- — четырежды сульфированный фталоцианин цинка, DPhPC — дифитаноилфосфатидилхолин, DPhPG — дифитаноилфосфатидилглицерол.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 09-065, 08.11.2009.
** Адресат для корреспонденции.
1603
2*
Фотодинамическая инактивация микроорганизмов основана на повреждении клеток активными формами кислорода, которые генерируются экзогенными или эндогенными сенсибилизаторами в фотовозбужденном состоянии
[I]. Эффективными агентами для фотодинамической инактивации бактерий оказались, в частности, фталоцианины цинка и алюминия [2—4], механизм действия которых включает образование цитотоксического синглетного кислорода (1О2) [5].
Плазматическая мембрана является одной из главных критических мишеней фотоокислительной деструкции в клетках различного происхождения [6, 7]. Ее необратимое повреждение приводит к вытеканию внутриклеточного содержимого, включая АТФ и ионы К+, инактивации ферментов и транспортных систем [8]. Троп-ностью к плазматической мембране обладают различные липофильные (протопорфирин IX, незамещенные фталоцианины и др.) и амфи-фильные (гематопорфирин, дейтеропорфирин, хлорины и др.) красители, которые эффективны в фотосенсибилизации раковых клеток [9], дрожжей [10] и грамположительных бактерий
[II]. Однако незаряженные липофильные красители, так же как антибиотики и детергенты [12], не могут преодолеть барьер проницаемости клеток грамотрицательных штаммов — отрицательно заряженную наружную клеточную мембрану, а потому не проявляют активности в отношении этой группы бактерий. Анионные гидрофильные красители неэффективны, а анионные амфифильные — малоэффективны в фотосенсибилизации грамотрицательных бактерий [13], что может быть обусловлено их электростатическим отталкиванием от отрицательно заряженной поверхности наружной мембраны. Напротив, в ряде работ показано, что катионные красители сенсибилизируют к видимому свету клетки не только грамположительных, но и грамотрица-тельных штаммов [4, 8, 13, 14].
Заряд наружной мембраны у грамотрицатель-ных бактерий преимущественно обусловлен составляющими ее внешний слой липополисахари-дами (ЛПС) [15] и сильно зависит от кислотности среды: при значениях рН ниже изоэлектричес-кой точки клеток, находящейся в пределах рН 1,5—4,5 [16], общий заряд клеток приобретает положительные значения, а при рН выше изоэлект-рической точки (в том числе при физиологических значениях рН) — отрицательные. Суммарный отрицательный заряд ЛПС связан с высоким содержанием отрицательно заряженных групп в центральной части этих макромолекул — остатками фосфорной кислоты, присоединенными к Д-глюкозамину липида А, и/или гептозах кора —
карбоксильными группами остатков 3-дезокси-Д-маннооктулозоновой кислоты, и кислых Сахаров кора — глюкуроновой кислоты [15].
Для изучения взаимосвязи эффективности связывания красителей с клетками грамотрицательных бактерий и их фотобактерицидной активности в настоящей работе использовали замещенные фталоцианины цинка и алюминия. Выбор данной группы красителей обусловлен, наряду с высоким квантовым выходом образования синглетного кислорода, наличием в ней широкого спектра полианионных и поликати-онных соединений, несущих до 8 ионных заместителей. Структуры и обозначения фталоциани-нов представлены на рис. 1. Физико-химические характеристики красителей были изучены ранее [5].
Целью настоящей работы было исследование электростатического взаимодействия замещенных металлофталоцианинов с клетками эн-теробактерий как представителей группы грам-отрицательных видов и связи этого процесса с эффективностью фотосенсибилизации. Были изучены две группы факторов, влияющих на взаимодействие красителей с поверхностью бактериальных клеток и искусственных мембран. С одной стороны, это знак заряда и количество ионных заместителей в молекулах фтало-цианинов, а с другой — факторы, определяющие заряд связывающей поверхности (липидный состав мембран, содержание в среде ионов двухвалентных катионов Mg2+ и Ca2+, pH и видовые особенности структуры и заряда ЛПС).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Октакарбоксифталоцианин цинка ZnPc8- являлся индивидуальным соединением, остальные препараты представляли собой смеси разнозаме-щенных компонентов со средней степенью замещения п. В работе использован сульфированный фталоцианин алюминия (фотосенс, AlPc3-) производства «НИОПИК» (Россия). Катионные тет-ракис- или октакис(пиридиниометил)фталоциа-нины цинка и хлоралюминия (ZnPcPym4+, AlPcPym4+, ZnPcPym8+, AlPcPym8+) и октакис(хо-линил) фталоцианин цинка (ZnPcChol8+) синтезированы по методикам, приведенным в работе [5]. Значения квантовых выходов генерации синг-летного кислорода (Фд) фталоцианинов в водных растворах, измеренные ранее в работах [17—19], приведены в таблице. Тетрасульфофталоцианины алюминия и цинка AlPc4- и ZnPc4- были произведены фирмой «Porphyrin Products» (США). В работе использованы грамицидин А («Sigma», США) и липиды («Avanti Polar Lipids», США).
Рис. 1. Структуры и обозначения фталоцианинов. п — Средняя степень включения заместителей R
Эксперименты со штаммами грамотрицатель-ных бактерий (из группы энтеробактерий) клинического происхождения проводили на Escherichia coli, Salmonella enteritidis и Proteus mirabilis. Материал агаровых культур бактерий, выращенных при 37° в течение 24 ч на Trypcase Soya Agar («bioMerieux», Франция), суспендировали в изотоническом (0,9%) растворе хлорида натрия и доводили показатель мутности суспензии до 1,0 McF (в единицах Мак-Фарланда) с использованием денситометра «Densimat» («bioMerieux»). Эффективность фотодинамической инактивации оценивали по тесту уменьшения колониеобразующей способности. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли стандартным способом после высева на Trypcase Soya Agar 0,1 мл множественных разведений контрольных и опытных (обработанных фотосенсибилизатором в темноте и/или облученных) образцов и культивирования в течение 1 сут. при 37° в режиме термостатирования.
Для определения фотобактерицидной активности различных фталоцианинов использовали бактериальную биолюминесцентную тест-систему на основе генно-инженерного штамма E. coli (pXen7), биолюминесценция которого обусловлена клонированным полным lux-опероном из светящихся почвенных энтомопатогенных
бактерий Photorhabdus luminescens [20]. Ранее нами была выявлена корреляция между фотосен-сибилизированным тушением биолюминесценции тест-культур E. coli pXen7 и их инактивацией, а также инактивацией эталонного штамма бактерий E. coli ATCC 25922 в единицах КОЕ, на основании чего рутинный способ определения КОЕ может быть заменен экспресс-методом измерения интенсивности биолюминесценции [13, 20]. К настоящему времени механизм фото-сенсибилизированного тушения бактериальной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.