МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 6, с. 908-911
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 579.26
эндофитный и эпифитный штаммы лгозртшим
ВКАЗИЕШЕ по-разному отвечают на стресс,
вызываемый тяжелыми металлами
© 2007 г. А. А. Камнев1, А. В. Тугарова, Л. П. Антоншк
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
Поступила в редакцию 07.05.2007 г.
Интерес к образованию внутриклеточных по-лигидроксиалканоатов (ПГА) у бактерий связан как с фундаментальными аспектами данного явления, так и со свойствами этих коммерчески ценных биоматериалов, в первую очередь - их способностью к полной биодеструкции и термопластичностью [1, 2]. У многих почвенных бактерий индукция биосинтеза ПГА и, в частности, поли-3-гидроксибутирата (ПГБ), как известно, является специфическим клеточным ответом на некоторые виды стресса [3]. У Azospirillum brasilense биосинтез и накопление ПГБ отмечались, в частности, при высоких значениях соотношения С : N в среде (дефицит азота); при этом накопление ПГБ считается одним из факторов, способствующих выживанию ризобактерий в неблагоприятных условиях [3, 4].
Насколько нам известно, для бактерий в условиях стресса, вызванного лишь присутствием тяжелых металлов (ТМ), индукция биосинтеза ПГА не описана (см., например, обзоры [1, 3]). Однако ранее нами в ряде случаев отмечались признаки накопления полиэфирных соединений в клетках A. brasilense в присутствии ионов некоторых ТМ, наряду с другими метаболическими изменениями, наблюдавшимися при исследовании клеток методами колебательной спектроскопии [5-7]. Следует отметить, что инфракрасная (ИК) спектроскопия наиболее чувствительна к присутствию полярных молекул и, в частности, полиэфиров вследствие наличия у них специфических интенсивных полос поглощения, что позволяет анализировать препараты целых клеток без выделения и очистки компонентов [7-10].
Целью настоящей работы было сравнительное исследование влияния ряда тяжелых металлов на метаболизм эпифитного и эндофитного штаммов A. brasilense.
С помощью метода ИК-спектроскопии проведен анализ клеток штамма Sp7, способного колонизировать лишь поверхность корня, и штамма Sp245 - факультативного эндофита, выращенных
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: aakamnev@ibppm.sgu.ru).
как на малатно-солевой среде (контроль), так и в условиях умеренного стресса, вызванного присутствием 0.2 мМ Co2+, Cu2+ или Zn2+ в среде культивирования.
В работе использовали бактерии A. brasilense (штаммы Sp7 и Sp245) из коллекции культур ИБФРМ РАН. Культуры выращивали на жидкой синтетической малатной среде следующего состава (г/л): K2HPO4 - 3.0; KH2PO4 - 2.0; NaCl - 0.1; яблочная кислота - 3.76; NaOH - 2.24; NH4Cl - 0.5; дрожжевой экстракт - 0.1; MgSO4 • 7H2O - 0.2; CaCl2 - 0.02; FeSO4 • 7H2O - 0.02; MnSO4 • 5H2O -0.1; Na2MoO4 • 2H2O - 0.002 (pH 6.8-7.0). Посевной материал и бактериальные клетки для анализа выращивали в конических колбах на 250 мл со 100 мл среды на качалке (180 об/мин) при 32°С. Стартовая плотность культуры во всех опытах составляла 5 х 107 кл/мл. Культуры выращивали на среде приведенного выше состава (контроль) и с добавлением соответствующих солей ТМ (опыт). Соли ТМ (CoCl2 • 6H2O, CuSO4 • 5H2O или ZnSO4 • 7H2O) добавлялись в виде стерильных растворов до конечной концентрации в среде 0.2 мМ.
Для проведения ИК-спектроскопического анализа бактериальные клетки собирали центрифугированием (15 мин, 7000 g), трижды отмывали от культуальной среды фосфатным солевым буфером (pH 7.0-7.2, порции по 15 мл) и высушивали до постоянной массы при комнатной температуре. ИК фурье-спектры образцов получали на ИК фурье-спектрометре "Perkin-Elmer" (модель 2000, Великобритания) или Nicolet (модель Magna-IR 560 E.S.P., США) в матрице KBr ("Merck") в режиме пропускания или диффузного отражения в диапазоне 4000-400 см-1 с накоплением до 100 разверток спектров (разрешение 4 см-1) при температуре 23 ± 2°C; обработку спектров проводили с помощью стандартных программ, поставляемых вместе со спектрометром.
Результаты показали, что клетки штамма A. brasilense Sp7, выращенные на контрольной среде, имели существенные отличия в ИК-спек-
ЭНДОФИТНЫЙ И ЭПИФИТНЫЙ ШТАММЫ Ахоштььим ВКАБИЕШЕ 909
Интенсивность (отн. ед.)
у/см 1
ИК-спектры целых клеток АгозртПит ЬгстИете штаммов 8р7 (А) и 8р245 (Б), выращенных в стандартной N1^ -содержащей среде (а) и в присутствии 0.2 мМ Со2+ (б), Си2+ (в) или 2п2+ (г).
910
КАМНЕВ и др.
трах по сравнению с клетками данного штамма, выращенными в присутствии ТМ (рисунок А, сравните спектр а и спектры б-г). В частности, в спектре клеток, выращенных в контрольной среде, выделяются типичные полосы амид I и амид II (около 1660 и 1540 см-1 соответственно) белковых компонентов, а также полоса колебаний фосфатных групп (1240 см-1), область колебаний связей C-O-C, C-C-O и C-O-P полисахаридов и других биомакромолекул (около 1100-950 см-1) и область наложения колебаний различных функциональных групп (менее 900 см-1) [9].
Выращенные в присутствии ТМ клетки A. brasilense Sp7 содержали в ИК-спектрах (рисунок, А, спектры б-г) хорошо заметную характерную полосу около 1727 см-1 валентных колебаний v(C=O) в полиэфирах, которая в контрольном образце (спектр а) наблюдалась лишь в виде слабого плеча. В области около 1440-1450 см-1 (деформационные колебания групп CH2 и CHз) и 1100950 см-1 (валентные колебания C-O-C и C-C-O) также заметно усиление поглощения по сравнению с полосами амид I и амид II. Все эти изменения указывают на накопление ПГБ в клетках штамма Sp7, выращенного в присутствии ТМ. В частности, по данным [10], ПГБ соответствует полоса с максимумом не выше 1730 см-1, тогда как другие ПГА дают полосы около 1732-1744 см-1. Учитывая как само положение полосы v(C=O) с максимумом около 1727 см-1, так и ее очевидную асимметрию (рисунок, А, спектры б-г), можно полагать, что в данном случае ПГБ доминирует при возможном присутствии других ПГА.
Следует также отметить низкочастотный сдвиг максимума полосы фосфатных групп тот 1240 см-1 (рисунок, А, спектр а) на 6-10 см1 (рисунок, А, спектры б-г), что соответствует увеличению степени гидратации этих групп, сопровождающему отмеченное ранее усиление общей гидратации бактериальных клеток, накапливающих ТМ из среды [5, 6].
В аналогичных условиях ИК-спектры клеток штамма A. brasilense Sp245, выращенных в присутствии ТМ, не показали сколько-нибудь существенных отличий от контроля (рисунок, Б; ср. спектры а и б-г). В частности, не наблюдалось появления характерной полосы у^^) около 1730 см-1 (помимо слабого плеча в данной области, аналогичного для всех образцов, включая контроль). Интересно, что при этом принципиальных различий в накоплении ТМ клетками штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7 не найдено [7]. Отметим также, что вызванные присутствием ТМ в среде изменения в ИК-спектрах целых клеток штамма Sp7 не могут быть обусловлены наличием самих соединений металлов вследствие их относительно малого об-
щего содержания в клетке, а отражают индуцируемую в присутствии ТМ перестройку метаболизма бактерии.
Таким образом, впервые для бактерий обнаружено накопление ПГБ в присутствии указанных тяжелых металлов при культивировании на полной NH+ -содержащей малатной среде для штамма A. brasilense Sp7. В то же время, штамм A. brasilense Sp245 в аналогичных условиях не отвечал увеличением синтеза ПГБ. Обнаружение индуцированного тяжелыми металлами накопления ПГБ клетками неэндфита A. brasilense Sp7 свидетельствует о его более гибких адаптационных возможностях, связанных, по-видимому, с локализацией данного штамма на поверхности корня, т.е. в прямом контакте с компонентами почвы в ризосфере, в отличие от штамма-эндофита A. brasilense Sp245, способного проникать внутрь корня [11].
Авторы благодарят проф. П.А. Тарантилиса и проф. М.Г. Полиссиу (Р.А. Tarantilis, M.G. Polis-siou; Афины, Греция) за сотрудничество.
Работа частично поддержана грантами NATO (LST.CLG.977664, LST.NR.CLG.981092, ESP.NR.NRCLG 982857) и Комиссии РАН по работе с молодежью (грант 205, VI Конкурс-экспертиза).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. LenzR.W.,MarchessaultR.H. Bacterial polyesters: Biosynthesis, biodegradable plastics and biotechnology // Biomacromol. 2005. V. 6. № 1. P. 1-8.
2. Волова Т.Г., Гладышев MM., Трусова М.Ю., Жила НО. Изучение деградации полигидроксиалка-ноатов и состава микроорганизмов-деструкторов в природных условиях // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 682-688.
3. Kadouri D, Jurkevitch E, Okon Y, Castro-Sowinski S. Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates // Crit. Rev. Microbiol. 2005. V. 31. № 2. P. 55-67.
4. Kadouri D, Jurkevitch E, Okon Y. Involvement of the reserve material poly-P-hydroxybutyrate in Azospiril-lum brasilense stress endurance and root colonization // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 6. P. 32443250.
5. Kamnev A A, Tarantilis PA, Antonyuk L.P., Bespalo-va L. A., Polissiou M. G., Colina M., Gardiner P. H.E., Ig-natov V. V. Fourier transform Raman spectroscopic characterisation of cells of the plant-associated soil bacterium Azospirillum brasilense Sp7 // J. Mol. Struct. 2001. V. 563-564. P. 199-207.
6. Kamnev A A., Antonyuk L.P, Tugarova A.V., Tarantilis PA, Polissiou M.G, Cardiner P.HE. Fourier transform infrared spectroscopic characterisation of heavy metal-induced metabolic changes in the plant-associated soil bacterium Azospirillum brasilense Sp7 // J. Mol. Struct. 2002. V. 610. № 1-3. P. 127-131.
7. Kamnev A A., Tugarova A.V., Antonyuk L.P., Tarantilis PA, Kulikov LA, Perfiliev Yu.D., Polissiou M.G.,
ЭНДОФИТНЫЙ И ЭПИФИТНЫЙ ШТАММЫ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
911
Gardiner P.H.E. Instrumental analysis of bacterial cells using vibrational and emission Mossbauer spectroscopic techniques // Anal. Chim. Acta. 2006. V. 573-574. P. 445-452.
8. Schmitt J., Flemming H.-C. FTIR-spectroscopy in microbial and material analysis // Int. Biodeterior. Biode-grad. 1998. V. 41. № 1. P. 1-11.
9. Naumann D. Infrared spectroscopy in microbiology // Encyclopedia of Analytical Chemistry / Ed. Meyers R.A. Chichester: Wiley, 2000. P. 102-131.
10. Hong K., Sun S., Ti
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.