МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 4, с. 609-616
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 577.21
ЭНДОНУКЛЕАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ РЕТРОТРАНСПОЗОНА Penelope
© 2004 г. К. И. Пятков1, Е. С. Зеленцова2, М. Б. Евгеньев1' 2*
1Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 17.11.2003 г.
Мобильный элемент Penelope - один из нескольких элементов, активируемых в скрещиваниях между определенными линиями у Drosophila virilis. В потомстве от одного направления этих скрещиваний наблюдается гонадная стерильность, появляются мутации и нарушается онтогенез. Это явление, называемое "синдромом гибридного дисгенеза", сопровождается мобилизацией ряда неродственных транспозонов, причем элемент Penelope, по-видимому, - ключевой в этом синдроме. Этот элемент имеет уникальное строение и сочетает в себе признаки как ДКП-содержащих, так и по-ли(А)-содержащих ретротранспозонов. Компьютерный анализ последовательности белка Penelope показал, что этот белок содержит домен обратной транскриптазы, а его С-концевой домен, в принципе, может обладать эндонуклеазной активностью, подобной активности бактериальной эндонук-леазы UvrC и эндонуклеаз, кодируемых интронами группы I. Ни в одном из ранее описанных ретро-элементов такая эндонуклеаза не предсказана. Множественное выравнивание показывает, что предполагаемый каталитический домен Penelope содержит пять консервативных мотивов, а также все необходимые каталитические аминокислотные остатки, характерные для эндонуклеаз семейства GIY-YIG. В данной работе экспериментально показано, что элемент Penelope действительно кодирует функционально активную эндонуклеазу, обладающую некоторой специфичностью к естественному сайту встраивания.
Ключевые слова: Drosophila virilis, ретротранспозон, эндонуклеаза GIY-YIG.
DETERMINATION OF THE ENDONUCLEASE ACTIVITY ENCODED BY RETROTRANSPOSONE Penelope, by K. I. Pyatkov1, E. S. Zelentsova2, M. B. Evgen'ev1 2* ^Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Science, Pushchino, Mosœw region, 142290 Russia; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Science, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: evgenev@genome.eimb.relarn.ru). Mobile element Penelope is mobilized in the course of hybrid dysgenesis in D. virilis. This element is also responsible for the activation of other unrelated families of TE occurring in the progeny of dysgenic crosses. Penelope elements have extremely variable structure and combine some properties of LiNEs and LTR-containing elements. Penelope-like elements (PLEs) have been recently described in various organisms including fish species, rotifers and amoebae. Computer analysis enabled to predict the presence of reverse transcriptase domain in Penelope-encoded polyprotein as well as UvrC type endonuclease at the C-end of the element. It is noteworthy that none of the previously described retroelements was shown to contain such a nuclease. Multiple alignments revealed five conservative catalytic motifs and all conservative residues present in GIY-YIG endonuclease family within Penelope-encoded protein. Herein we have demonstrated that Penelope element isolated from D. virilis encodes functionally active endonuclease exhibiting some sequence-specificity to the sequence previously demonstrated to serve as Penelope genomic insertion site.
Исходно мобильный элемент Penelope был выделен из D. virilis в процессе изучения синдрома гибридного дисгенеза [1]. У D. virilis этот синдром включает высокую стерильность гибридов от дис-генных скрещиваний, появление множества точечных мутаций и хромосомных перестроек и ряд других нарушений [1, 2]. Ранее в опытах на D. mel-
Принятые сокращения: ДКП - длинный концевой повтор; МГЭ - мобильный генетический элемент; ОРС - открытая рамка считывания; ОТ - обратная транскриптаза; PLE (Penelope like element) - элемент, подобный элементу Penelope.
*Эл. почта: evgenev@genome.eimb.relarn.ru
anogaster обнаружено, что имеются три независимые друг от друга системы гибридного дисгенеза, связанные с активацией трех разных семейств мобильных генетических элементов (МГЭ) [3-5]. Так же, как и в случае D. melanogaster, у D. virilis синдром гибридного дисгенеза наблюдается, преимущественно, только в потомстве F1, полученном в одном направлении скрещиваний между определенными линиями этого вида. В отличие от аналогичных систем у D. melanogaster, у D. virilis в результате дисгенных скрещиваний мобилизуется не один, а, по крайней мере, шесть неродственных МГЭ [1, 6, 7] - Penelope, Ulysses, Helena, Paris,
Telemac и Tv1. Из них именно Penelope играет ключевую роль в "запуске" всего синдрома и в активизации всех остальных элементов [1, 8]. По аналогии с Р-М-системой гибридного дисгенеза, описанного у D. melanogaster [3, 9], линии D. virilis, содержащие копии Penelope, относят к Р-цитоти-пу, а линии, не имеющие Penelope, к М-цитотипу. В последние годы Penelope-подобные элементы (PLE) обнаружены в десятках различных организмов, включая амфибий, рыб, червей и амеб [10, 11]. Филогенетический анализ белка, кодируемого Penelope, а также анализ структуры ее транскрипта позволили заключить, что этот элемент и подобные ему не принадлежат ни к одному из двух главных классов ретроэлементов, а образуют отдельный, весьма древний класс ретро-транспозонов [11].
При помощи компьютерного анализа первичной структуры белка МГЭ Penelope показано, что он содержит обратную транскриптазу (ОТ) [1]. Кроме того, С-концевой домен, вероятно, обладает эндонуклеазной активностью, подобной активности бактериальной эндонуклеазы UvrC и эндо-нуклеаз, кодируемых интронами группы I [12-14]. При дисгенезе в ДНК D. virilis происходит перемещение и классических "ДНК-овых" транспозо-нов (Paris), и ретротранспозонов (Penelope, Helena, Ulysses, Telemac, Tvl), поэтому, с нашей точки зрения, именно активность эндонуклеазы, кодируемой Penelope, могла бы обеспечивать необходимые условия (разрывы в ДНК) для перемещения неродственных семейств МГЭ. Если это предположение верно, то у всех элементов, мобилизуемых при дисгенезе, должны совпадать наиболее часто встречающиеся точки встраивания. Недавно показано, что в геноме D. virilis и близких видов группы virilis элементы Penelope и Ulysses, действительно, часто находятся в одних и тех же районах [15, 16]. В настоящее время функционально не охарактеризован ни один из элементов, принадлежащих к классу PLE, поэтому изучение структуры Penelope и энзиматических активностей кодируемого им белка весьма актуально. Работа в этом направлении необходима для формирования современных представлений о молекулярных механизмах, обеспечивающих перемещение данного ретротранспозона в геноме, и о его взаимосвязи с другими мобильными элементами, перемещение которых наблюдается при дисгенезе у D. virilis и, по-видимому, зависит от активности Penelope.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Олигонуклеотидные праймеры. Для создания рекомбинантных плазмид использовали следующие олигонуклеотиды: 1 - 5'-CCACCATTTG-GCAAGCAA-3'; 2 - 5'-GATGTGATCCGACGGAC-3'; 3 - 5 '-AAGCCATTTGCATTGGGTTCAG-3 '; 4 -
5'-GCATTCCGTTTGCCATACGC-3'; 5 - 5'-TTCCA-TGGAAAGGTCGCCAGAGCC-3'; 6 - 5'-TTTCTC-GAGCACGTCTGCGCTTTTTGAC-3 '. Для опытов по удлинению меченого праймера ("primer extension") использовали олигонуклеотиды 1 и 2.
Получение рекомбинантных плазмид. Области встраивания psi МГЭ Penelope в М-подобной линии 9 D. virilis амлифицировали с помощью ПЦР и праймеров 1 и 2, 3 и 4 и клонировали в векторе pUC19 по сайту SmaI с образованием плазмид pUCpsi.
Плазмиду-донор получали в результате амли-фикации полноразмерной ОРС Penelope в ПЦР с использованием праймеров 5 и 6 с последующим клонированием в векторе pET23d по сайтам NcoI-XhoI. Плазмиду-мишень получали в результате клонирования EcoRI-HindIII-фрагмента плазми-ды pUCpsi в векторе р15 по сайтам EcoRI-HindIII.
Иммунологическая реакция. Белки фракционировали с помощью электрофореза по Лэммли в 10%-ном ПААГ. Электроперенос белков на нит-роцеллюлозную мембрану Hybond-C и все этапы иммунологической реакции проводили по протоколу ECL Western blotting analysis system ("Amer-sham Pharmacia Biotech").
Выделение плазмидной ДНК в неденатуриру-ющих условиях. Клетки E. coli трансформировали двумя плазмидами и экспрессию ОРС Penelope индуцировали, добавляя ИПТГ до концентрации 1 мМ. Индукцию проводили при 27°С в течение 3 ч. Плазмидную ДНК в неденатурирующих условиях выделяли по методу Коллеукс и соавт. [17]. 1.5 мл культуры осаждали, промывали 1 мл раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 25% сахарозу, центрифугировали и повторно ресус-пендировали в 140 мкл этого же раствора. К суспензии добавляли 7 мкл раствора лизоцима (50 мг/мл), выдерживали при комнатной температуре 10 мин, вносили 50 мкл 0.5 М ЭДТА (рН 8.0), перемешивали и инкубировали в ледяной бане 5 мин. Затем добавляли 250 мкл раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 0.1% тритона X-100, 62 мМ ЭДТА, перемешивали и выдерживали в ледяной бане 10 мин. Лизат осветляли центрифугированием при 13000g в течение 15 мин. К лизату добавляли РНКазу А до концентрации 0.1 мг/мл, инкубировали 10 мин при 37°С, а затем белки удаляли, встряхивая с равным объемом смеси фенол/хлороформ. Отбирали верхнюю фракцию, добавляли 0.5 объема 7.5 М ацетата аммония и 2.5 объемов 96% этилового спирта. Смесь охлаждали (-70°C, 30 мин) и центрифугировали 5 мин. Осадок дважды промывали 75% этиловым спиртом, подсушивали и растворяли в 30 мкл буфера Те.
Последовательность ДНК определяли по методу Сэнгера [18] с использованием [a-33P]dATP или [a-32P]dATP. Стадартную реакцию секвени-рования ДНК, электрофорез в 6%-ном ПААГ и
радиоавтографию выполняли в соответствии с протоколом Sequenase 2.0 ("Amersham").
Опрeдeлeниe эндoнyклeaзнoй aктивнocти Penelope. Положение точек расщепления ДНК определяли, используя методику "удлинения" 32Р-ме-ченного праймера (primer extention) [19]. &адию мечения и реакцию удлинения праймера проводили по протоколу ReaderTM DNA Sequ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.