МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 886-900
= ДНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 547.963.32.057:542.96
ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ТИПА 11Е И ИР, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С ДВУМЯ УЧАСТКАМИ УЗНАВАНИЯ В ДНК
© 2004 г. О. В. Кирсанова1' 2, В. Б. Баскунов1, Е. С. Громова1*
1 Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 117984
Поступила в редакцию 20.04.2004 г.
В последние годы обнаружено, что широко используемые в генной инженерии и молекулярной биологии эндонуклеазы рестрикции многообразны не только по узнаваемым нуклеотидным последовательностям, но и по механизму их взаимодействия с ДНК. В обзоре рассмотрены эндонуклеазы рестрикции типа ПЕ и ИБ, которым для эффективного расщепления ДНК необходимо одновременное взаимодействие с двумя нуклеотидными последовательностями. Обсуждаются особенности структуры этих ферментов и их комплексов с ДНК, их постадийное взаимодействие с ДНК, каталитические механизмы реакции, образование петель в ДНК. У эндонуклеаз типа 11Е обнаружен новый тип ДНК-белкового узнавания, когда две копии одного и того же участка ДНК специфически взаимодействуют с двумя разными аминокислотными последовательностями и двумя разными структурными мотивами в одной полипептидной цепи.
Ключевые слова: эндонуклеазы рестрикции, "двухсайтовый" механизм, структура, узнавание ДНК, кинетические схемы, каталитические мотивы, архитектура активного центра.
TYPE IIE AND IIF RESTRICTION ENDONUCLEASES INTERACTING WITH TWO RECOGNITION SITES IN DNA, by O. V. Kirsanova1-2, V. B. Baskunov1, E. S. Gromova1-* (^Department of Chemistry, Moscow State University, Moscow, 119992 Russia; E-mail: gromova@genebee.msu.ru; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117984 Russia). Recently, it was revealed that restriction endonucleases widely used in genetic engineering and molecular biology are diverse not only in DNA sequence specificities but also in mechanisms of their interaction with DNA. In the review type IIE and IIF restriction endonucleases which require the simultaneous interaction with two copies of their recognition sequence for effective hydrolysis of dNa are considered. Crystal structures of these enzymes and their complexes with DNA as well as stepwise interaction with DNA, mechanisms of catalysis and enzyme-mediated DNA looping are discussed. A novel type of DNA-protein recognition was found for type IIE endonucleases when two copies of the same DNA sequence specifically interact with two different amino acid sequences and two structural motifs located in one polypeptide chain.
1. ВВЕДЕНИЕ
Гены систем рестрикции-модификации (РМ) составляют до 1% генома прокариотических организмов [1]. Защитная функция систем РМ основана на том, что эндонуклеаза рестрикции (ЭР) расщепляет чужеродную ДНК, а сопутствующая ДНК-метилтрансфераза защищает собственную ДНК от гидролиза метилированием остатков гетероциклических оснований в этих же участках [1-4]. ЭР, принадлежащие к системам РМ типа II, узнают определенные короткие нуклеотидные последовательности и в присутствии ионов Mg2+ расщепляют обе цепи ДНК внутри участка узнавания или вблизи него с образованием 5'-концево-
го фосфата и З'-гидроксильной группы [1, 4]; при
*
Эл. почта: gromova@genebee.msu.ru
этом получаются либо "липкие", либо "тупые" концы.
К настоящему времени охарактеризовано около 4000 ЭР типа II, узнающих около 250 вариантов коротких нуклеотидных последовательностей. Основные свойства ЭР типа II суммированы в обзорах [1-6]. ЭР типа II - одно из самых обширных семейств ферментов, катализирующих один тип реакции, но обладающих разной специфичностью [5]. Это многообразие обусловило широкое применение таких ферментов в генной инженерии. Изучение механизма действия ЭР важно для понимания механизма узнавания и расщепления ДНК ДНК-связывающими ферментами, в частности, ферментами с нуклеазной активностью (нуклеазами, рекомбиназами, резольвазами, транспозазами, интегразами, белками, участвую-
щими в репарации). Как выяснилось за последнее время, ЭР могут служить объектами при изучении эволюционных взаимосвязей между ферментами различных семейств. Информация о структуре и механизме функционирования этих ферментов необходима также для расширения области их практического применения.
Со времени открытия ферментов рестрикции в 70-х годах XX в. увеличилось не только их число, но выявлены также новые свойства и особенности узнавания участков в ДНК и ее расщепления. В связи с этим недавно введена новая номенклатура ферментов РМ [7]. Тип II разделили на 11 подтипов: IIA, IIB, IIC и т.д. Остановимся на некоторых из них. К ЭР типа IIP относят гомодимер-ные белки, узнающие в ДНК короткие палинд-ромные последовательности. Они симметрично расщепляют две цепи ДНК внутри этой нуклео-тидной последовательности или непосредственно рядом с ней (по одному разрыву на ДНК-цепь). ЭР типа IIB расщепляют каждую цепь ДНК с обоих концов участка узнавания. ЭР типа IIS узнают несимметричную последовательность и расщепляют ДНК за пределами участка узнавания на определенном расстоянии от него. В представленной классификации можно выделить ЭР, которым для расщепления ДНК необходимо одновременное взаимодействие с двумя узнаваемыми последовательностями. Это типы IIE и IIF [7, 8]. ЭР типа IIE взаимодействуют с двумя участками узнавания, расщепляя при этом лишь один из них и используя второй в качестве аллостерического эффектора (табл. 1) [9, 10]. ЭР типа IIF взаимодействуют с двумя участками узнавания в ДНК и одновременно гидролизуют все четыре фосфоди-эфирные связи (табл. 1) [11-14]. В последнее время появляется все больше данных о том, что не только ЭР типа IIE и IIF способны взаимодействовать с двумя участками узнавания. Оказалось, что многие ЭР типа IIS, а также некоторые ЭР типа IIB расщепляют ДНК с двумя участками узнавания более эффективно, чем с одним [15, 16].
Свойства некоторых представителей ЭР типа IIE, IIF и IIS, а также методологические аспекты определения типа изучаемой ЭР суммированы в обзорах [1, 8, 17].
Настоящий обзор посвящен детальному рассмотрению молекулярных механизмов специфического узнавания двух нуклеотидных последовательностей в ДНК и расщепления ее ЭР типа IIE и IIF.
2. ЭФФЕКТ УСТОЙЧИВОСТИ НЕКОТОРЫХ МОЛЕКУЛ ДНК К РАСЩЕПЛЕНИЮ ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ РЕСТРИКЦИИ
Более 10 лет тому назад было замечено, что некоторые ЭР типа II (например, NaeI, EcoRII,
Таблица 1. Основные представители эндонуклеаз типа IIF и IIE
Подтип Фермент Участок узнавания в ДНК (стрелкой показано место расщепления)*
IIF SfiI GGCCNNNNiNGGCC
NgoMIV GiCCGGC
Cfr10I RiCCGGY
Bse634I RiCCGGY
IIE NaeI GCCiGGC
EcoRII iCCWGG
Sau3AI iGATC
NarI GGiCGCC
* N = А, С, G или T; R = А или G; Y = С или T; W = А или T.
BspMI, HpaП, SacП, AtuBI, Cfr9I, SauBMKI, Eco57I и Ksp632I) гидролизуют протяженные молекулы ДНК, содержащие небольшое количество (от одного до четырех) участков узнавания, менее эффективно, чем протяженные ДНК с часто повторяющимися участками узнавания [9, 10, 18, 19].
Например, двухцепочечные ДНК фагов Т3 и Т7 (три и два участка узнавания соответственно) "устойчивы" к действию EcoRII [9]. Напротив, ДНК бактериофага X, содержащая 71 участок узнавания EcoRII, а также некоторые плазмидные ДНК, в том числе pBR322 (шесть участков узнавания), расщеплялись очень эффективно. При добавлении легко гидролизующихся субстратов к "устойчивым" ДНК происходила активация расщепления последних. Гидролиз ДНК Т3 также достигался прибавлением 14-звенных ДНК-дуплексов, содержащих один участок узнавания [20]. Следует отметить, что сами односайтовые короткие субстраты эффективно расщеплялись EcoRII.
ЭР NaeI не расщепляла ДНК фага М13 (один участок узнавания этого фермента) [10]. Добавление расщепляемых NaeI ДНК pBR322 или SV40 значительно ускоряло гидролиз ДНК М13.
Эти наблюдения позволили предположить, что для некоторых ЭР типа II характерен "двух-сайтовый" механизм действия. Они способны одновременно связывать две молекулы ДНК (два участка узнавания). Такое взаимодействие необходимо для расщепления ДНК.
Интересно отметить, что присутствие в геномах некоторых бактериофагов небольшого числа участков узнавания рассматриваемых ЭР неслучайно. Например, согласно статистическим расчетам, в геномной ДНК бактериофага Т7 должно быть 56 участков узнавания EcoRII, тогда как в действительности их только два [21]. Предполагается, что таким образом обеспечивается защи-
Рис. 1. Структурная организация комплекса ^оМГУ с расщепленной ДНК (1БГО - идентификационный код структуры в Брукхэвенском белковом банке данных) [13]. Четыре субъединицы ^оМПУ (выделены полутонами) связаны с двумя молекулами ДНК (ша-ро-стержневая модель).
та бактериофагом своей ДНК от действия системы РМ. Напротив, геном бактериофага X содержит большое количество участков узнавания ЕеоИП, поскольку в виде профага он реплицируется вместе с геномом клетки-хозяина, которая защищена от расщепления.
3. СТРУКТУРНОЕ СХОДСТВО ЭНДОНУКЛЕАЗ ТИПА IIE И IIF С ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ ТИПА IIP И С ФЕРМЕНТАМИ ДРУГИХ СЕМЕЙСТВ
Среди первичных структур ЭР типа II (в том числе, IIP, IIE и IIF) не выявлено какой-либо существенной гомологии (за исключением структурных мотивов, ответственных за катализ (раздел 5.8), и некоторых других мотивов (раздел 5.2)) [1]. Ранее считалось, что эти ферменты эволюци-онно не связаны [1]. Однако с определением все большего числа кристаллических структур ЭР типа IIP стало очевидно, что они имеют очень похожую структуру участка белка, включающего активный центр (каталитический "кор") [6]. Каталитический "кор" ЭР типа IIP образован че-тырьмя-пятью отрезками Р-структуры с примыкающими к ним с обеих сторон а-спиралями [1, 4, 6]. Кроме того, отмечено сходство пространственных структур ЭР в зависимости от того, расщепляют они ДНК с образованием липких (по типу EcoRI и ряда других ЭР - BamHI, BglII, MunI, BsoBI) или тупых концов (по типу EcoRV и ряда других ЭР - BglI и PvuII) [6].
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.