ш
УДК 577.336+577.323
ЭНЕРГИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В АКТИНОМИЦИН-НУКЛЕОТИДНЫХ КОМПЛЕКСАХ
© 2014 г. М. М. Хайретдинова, Н. Л. Векшин#
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл. Поступила в редакцию 05.08.2013 г. Принята к печати 29.08.2013 г.
С помощью высокочувствительной спектрофотометрии изучены комплексы природного гетероциклического антибиотика актиномицина Д (АМД) с его возможными переносчиками: пуриновыми и пи-римидиновыми нуклеотидами, а также с фрагментированной ДНК и фосфолипидными липосомами. Антибиотик не только сорбируется на поверхности пуриновых кластеров, но и встраивается в них. Особенно хорошо он встраивается в расплетенные участки ДНК. Встраивание сопровождается длинноволновым сдвигом спектра поглощения. По величине сдвига рассчитана энергия взаимодействия. В случае АМД с кофеином и аденозином она составляет 2.4 и 2.7 ккал/моль, а с гуанозином и с фрагментированной ДНК — заметно выше: 3.3 и 3.7 ккал/моль. Предполагается, что гуанозин, аденозин, кофеин и фрагментированная ДНК могут служить переносчиками антибиотика.
Ключевые слова: кофеин, аденозин, гуанозин, липосомы, фрагментированная ДНК, актиномицин.
Б01: 10.7868/80132342314010060
ВВЕДЕНИЕ
Актиномицины — эффективные цитостатиче-ские антибиотики [1—3], применяемые при хи-миотерапевтическом лечении сарком, лимфом, меланом и т.п. [4—6]. Актиномицин Д (АМД) — наиболее широко используемый представитель семейства актиномицинов; он состоит из фенок-сазонового хромофора и двух пептидо-лактонных колец [1, 2]. Высокая цитостатическая и противоопухолевая активность АМД связана с его действием на ДНК: после встраивания происходит ингибирование РНК-полимеразной реакции, нарушение синтеза белка и клеточного деления [3, 7, 8]. Также, встраиваясь в ДНК, АМД блокирует ядерные комплексы топоизомеразы I и II [9].
Интеркаляция АМД в кристаллы и сухие пленки ДНК происходит по стэкинговому типу — между нуклеотидами двойной спирали, но в растворе ДНК происходит нестэкинговое встраивание антибиотика (при его физиологически малых концентрациях) в расплетенные участки [10—12].
АМД является амфифильным соединением, плохо проникающим в опухолевые клетки. Проникновение требует высоких концентраций. Но при высоких концентрациях АМД становится токсичным не только для опухолевых, но и нормальных клеток.
#Автор для связи (тел.: +7 (4967) 73-94-32; эл. почта: пуекБЫп@гатЫег. ги).
Одним из путей уменьшения токсичности АМД в отношении нормальных клеток является снижение его концентрации, а также адресная доставка к опухолевым клеткам. Попытки доставки АМД в опухолевые клетки с помощью липосом, полипептидов, антител, синтетических полимеров и поверхностно-активных веществ оказались не очень удачными [13].
Ранее в нашей лаборатории были созданы фар-макосомы, содержащие комплекс АМД со шпилечным олигонуклеотидом НР1 и кофеином [14]. На примере флуоресцирующего 7-аминоактино-мицина Д, который можно детектировать в микромолярных концентрациях, было показано, что использование НР1 позволяет многократно снизить концентрацию антибиотика, но при этом усилить противоопухолевое действие [15]. Этот эффект достигается в результате внедрения гетероцикла антибиотика в шпильку НР1, что облегчает транспорт антибиотика через мембраны опухолевых клеток. На асцитной карциноме Эрлиха наблюдалось усиление (по сравнению со свободным АМД) проникновения АМД в комплексе с НР1 внутрь клеток [15]. Шпилька НР1 не препятствует перераспределению антибиотика на ДНК [16].
Помимо олигонуклеотидных шпилек, синтез которых трудоемок, а биологическое воздействие не всегда предсказуемо, переносчиками гетероциклических антибиотиков могут служить пури-новые и пиримидиновые нуклеотиды [17]. На-
пример, авторами работы [18] было проведено изучение с помощью ЯМР гетероассоциации АМД с кофеином при их миллимолярных концентрациях, найдены константы связывания и другие термодинамические параметры. Однако высокие (милли-молярные) концентрации АМД токсичны для нормальных клеток. Кроме того, в работе [18] не было учтено, что при миллимолярных концентрациях в водных растворах кофеин и другие пурины находятся не в мономерном виде, а спонтанно образуют упорядоченные агрегаты — кластеры [19—22]. Таким образом, для получения значимых результатов необходимо работать с меньшими количествами антибиотика и учитывать наличие кластеров.
Целью нашей работы являлось спектрофото-метрическое изучение взаимодействия АМД в относительно небольшой (200 мкМ) концентрации с пуриновыми и пиримидиновыми кластерами аденозина, гуанозина, кофеина и никотинамида, а также с фрагментированной ДНК и с фосфоли-пидными липосомами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Кластеры пуринов. Гуанозин, аденозин и кофеин — амфифильные соединения. В дистиллированной воде при концентрации выше 1 мМ они формируют небольшие упорядоченные агрегаты — кластеры, состоящие из 10—20 молекул [17—22]. Размер кластера составляет около 50—100 А, что многократно меньше длины световой волны. Поэтому при формировании кластеров раствор остается прозрачным (мутность пренебрежимо мала). Энергия взаимодействия между молекулами в кластере невелика и в значительной степени определяется гидрофобной составляющей.
Взаимодействие актиномицина Д с гуанозином.
Считается [1, 2], что среди оснований ДНК максимальным сродством к АМД обладает гуанин. Поэтому следует ожидать, что АМД в водном растворе (в дистиллированной воде) будет хорошо взаимодействовать с гуанозином (гуанин не используется, т.к. слишком плохо растворяется в воде). В воде гуанозин при миллимолярных концентрациях существует в виде кластеров [11, 20, 22], состоящих из двух десятков молекул.
При добавлении АМД (в концентрации 2 х х 10-4 М) к раствору гуанозина, взятому в 10-кратно большей концентрации (2 х 10-3 М) частично образовывались гетерокомплексы. При взятом соотношении один гуанозиновый кластер может связать в среднем не более одной молекулы антибиотика. Часть связанных молекул антибиотика сорбируется на поверхности кластера, а часть может встраиваться внутрь. При этом происходит снижение молярного коэффициента поглощения АМД, вызванное тем, что некоторые
Б
X, нм
Рис. 1. Спектр поглощения 0.2 мМ АМД в воде (1), спектр светорассеяния 2 мМ гуанозина (2) и спектр их смеси (3) в дистиллированной воде.
фотоны подвергаются светорассеянию на каждом из кластеров [19], не достигая встроенного в них антибиотика.
В спектре поглощения АМД в этих условиях наблюдается небольшой (всего 2 нм) сдвиг в длинноволновую сторону (рис. 1). Это говорит о некотором перераспределении электронной плотности в молекуле АМД, т.е. о межмолекулярном взаимодействии с гуанозином (вкладом гуанозина в поглощение в видимой области можно пренебречь; есть только небольшой вклад светорассеяния, рис. 1).
На первый взгляд, взаимодействие кажется незначительным. Однако на самом деле оно существенно. На рис. 2 показан разностный спектр, полученный вычитанием спектра АМД из спектра смеси АМД с гуанозином. Для этого сначала проводилось вычитание небольшого вклада светорассеяния гуанозина из спектра комплекса (в видимой области), затем делалась нормировка в максимуме на спектр свободного АМД в воде и потом бралась разность этих двух спектров. Процедура нормировки позволяет устранить вклад эффекта светорассеяния на вероятность поглощения фотонов антибиотиком в каждом отдельном кластере [19, 20, 22], а также нивелирует возможные неточности добавления веществ микропипеткой.
В разностном спектре (рис. 2), показывающем новую полосу поглощения АМД внутри гуанози-новых кластеров, максимум находится при 464 нм, т.е. спектральный сдвиг по отношению к АМД в воде составляет 24 нм. Энергия взаимодействия между АМД и гуанозином может быть оценена по величине сдвига в шкале волновых чисел (см-1). Сдвиг равен 1175 см-1, что соответствует энергии (по известному соотношению Е = Ну, где Н — постоянная
Б
Рис. 2. Разностные спектры АМД в кластерах гуанозина (1) и в ДНК (2).
Планка, V — волновое число) 3.3 ккал/моль. Это означает, что молекула антибиотика связана внутри гуанозинового кластера довольно прочно.
В разностном спектре имеется еще отрицательный пик — при 415 нм (рис. 2). Если исходить из известного правила спектроскопии [19], что при межмолекулярных взаимодействиях интенсивность новой полосы должна быть такой же, как снижение интенсивности исходной, то, судя по примерному равенству площади положительного и отрицательного пиков на рис. 2, можно заключить, что отрицательный пик АМД в гуанозиновых кластерах це-
ликом связан со спектральным сдвигом из-за межмолекулярных взаимодействий.
Взаимодействие АМД с аденозином и кофеином. При добавлении АМД (в концентрации 2 х х 10-4 М) к раствору аденозина или кофеина, взятых в 10-кратно большей концентрации (2 х х 10-3 М) наблюдается, как и в случае с гуанози-ном, длинноволновый сдвиг спектра (таблица). Статистическая значимость различий по энергии составляет около 0.3 ккал/моль. Здесь в разностных спектрах также наблюдался отрицательный пик в районе 415 нм, по площади близкий к длинноволновому пику.
Спектральные параметры актиномицина Д в разных комплексах
Компонент комплекса X, нм Б Дv, см 1 Е, ккал/М
- (в воде) 440 0.19 - - - -
Гуанозин 443 0.17 464 0.0191 1175 ± 10 3.3 ± 0.3
Аденозин 442 0.18 459 0.0088 940 ± 10 2.7 ± 0.3
Кофеин 441 0.15 457 0.0048 845 ± 10 2.4 ± 0.3
Фраг. ДНК 443 0.16 467 0.053 1310 ± 10 3.7 ± 0.3
Сахароза 440 0.19 440 0 0 ± 10 0 ± 0.3
Никотинамид 440 0.19 442 0.0009 103 ± 10 0.3 ± 0.3
Липосомы 442 0.15 440 -0.0001 -103 ± 10 0.3 ± 0.3
Примечание. X — длина волны в максимуме спектра; Б — оптическое поглощение в максимуме; Х^ — длина волны в максимуме длинноволновой полосы, полученной вычитанием спектра АМД в воде из спектра АМД в комплексе; Б^ — соответствующее оптическое поглошение разностной полосы; Av — спектральный сдвиг между максимумом АМД в воде (440 нм) и Хда; Е — энергия межмолекулярного взаимодействия.
Энергия взаимодействия АМД с аденозином и кофеином, вычисленная по величине спектрального сдвига, составляет 2.7 и 2.4 ккал/моль соответственно. Это заметно ни
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.