ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 416, № 3, с. 412-415
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.3
ЭНЗИМОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ХВОСТАТОГО ЯДРА МОЗГА ЛАДОЖСКОГО ТЮЛЕНЯ PHOCA HISPIDA LADOGENSIS
© 2007 г. Е. В. Розенгарт, Н. Е. Басова
Представлено академиком В.Л. Свидерским 10.04.2007 г. Поступило 10.04.2007 г.
Семейство холинэстераз (ХЭ), обладая выраженной видовой и тканевой специфичностью [1-3], является одной из самых многочисленных групп среди гидролаз (НФ 3) [4], хотя здесь оно представлено только двумя позициями под систематическими названиями ацетилхолин - ацетилгидро-лаза (НФ 3.1.1.7) и ацилхолин-ацилгидролаза (НФ 3.1.1.8) [4]. Безрезультатными оказались многочисленные попытки построить логичную классификационную схему, которая бы позволила четко отнести тот или иной препарат ХЭ к определенной номинации [2, 3]. Еще большая неопределенность царит в определении функциональной значимости ХЭ различных органов и тканей у разных животных. Пожалуй, единственным неоспоримым фактом является ключевая роль ХЭ в механизме нервного проведения при холинергическом типе нервной системы [1-3]. Все остальные предположения о защитной функции, об участии в изменении проницаемости мембран и т.д. не выходят за рамки гипотез [3]. И как это ни парадоксально, но среди огромного числа тестированных холинэстеразных объектов очень скромен список энзимологически подробно обследованных (с изучением субстратно-ингибитор-ной специфичности) препаратов ХЭ нервной ткани животных, стоящих на разных уровнях эволюционного развития, а что касается ХЭ мозга млекопитающих, то это вообще лишь единичные примеры [3, 5-10]. Этим критериям отвечают исследования ХЭ мозга крупного рогатого скота (в литературе этот объект называют "быком", хотя материал брали в виде смесовых проб на мясокомбинате) [5, 6, 8] и американской норки Mustela vison Bris [10]. Для ХЭ мозга крупного рогатого скота [6] была показана полная идентичность эн-зимологических характеристик с ХЭ эритроцитов крови (в случае норки [10] такое сравнение
было затруднено из-за низкой ферментативной активности ХЭ эритроцитов). Такое сходство свойств ХЭ мозга и эритроцитов подтвердило данные проведенного ранее исследования [11] действия четырех различных по структуре фос-форорганических ингибиторов (ФОИ) на активность ХЭ мозга, эритроцитов и сыворотки крови у группы различных млекопитающих. Оно показало, что чувствительность препаратов ХЭ мозга и эритроцитов была одинаковой к каждому из эффекторов и для каждого из видов животных.
Все эти данные стимулируют дальнейшие исследования субстратно-ингибиторной специфичности ХЭ мозговых препаратов млекопитающих. Интерес для сравнительной энзимологии представляют ферменты ластоногих, как полностью перешедших к водному образу жизни, что привело к выработке у них ряда новых приспособлений. Для ответа на вопрос, коснулись ли эти изменения свойств таких функционально важных ферментов, как ХЭ, мы провели изучение энзи-мологических характеристик ХЭ мозга тюленя Phoca hispida ladogensis Nordk., обитающего в Ладожском озере [7].
Источником фермента служил лиофилизиро-ванный препарат мозговой ткани тюленя, который перед опытом гомогенизировали в 0.1 М KCl (200 мг/мл) [7]. В качестве субстратов использовали коммерческие препараты ацетилхолинхло-рида ("Merck"), пропионилхолиниодида, бутирил-холиниодида, бензоилхолинбромида ("Chemapol") и ацетил-Р-метилхолинбромида ("Reanal"). Все фосфорорганические ингибиторы (ФОИ) (формулы см. табл. 2 и 4) синтезированы в Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН [1-3]. Активность ХЭ определяли методом продолжительного потенциометрическо-го титрования (pH 7.5, 25°C, 0.1 М KBr) [1, 2]. В качестве кинетических параметров субстратной и ингибиторной специфичности использовали логарифмы величин активности каталитического центра (lg, ac), отношения [ lg (ac/KM)] и бимолекулярной константы скорости взаимодействия ХЭ с
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
Таблица 1. Активность ХЭ в гомогенатах ткани разных отделов головного мозга ладожского тюленя, Phoca hispida ladogensis Nordk. и американской норки Mustela vison Bris
Отдел мозга Скорость гидролиза v, мкмоль АХ • мин-1 • мг-1
тюлень норка [10]
Хвостатое ядро 0.045 0.185
Мозжечок 0.012 0.014
Червь мозжечка 0.008 -
Серое вещество коры по- 0.006 0.015
лушарии переднего мозга
ФОИ (^, £п), а также отрицательный логарифм величин константы Михаэлиса (рКм) [2, 3].
Предварительные опыты показали очень низкую холинэстеразную активность в эритроцитах и в сыворотке крови тюленя [7]. В табл. 1 сопоставлена активность ХЭ в гомогенатах ткани разных отделов головного мозга ладожского тюленя и американской норки [10]. Для обоих млекопитающих активность ХЭ в хвостатом ядре была существенно выше, чем в других исследованных отделах головного мозга, причем если у тюленя это превосходство было 4-7-кратное, то у норки -больше, чем на порядок, а у человека - в 30 раз [12]. В целом ткань мозга тюленя по общему уровню активности ХЭ уступала ткани мозга норки, но была сопоставима с мозговой тканью ряда других млекопитающих [13].
Известно, что мозговая ткань млекопитающих содержит две ХЭ: ацетилхолинэстеразу (АХЭ; НФ 3.1.1.7) и бутирилхолинэстеразу (БХЭ), относящуюся к номинации НФ 3.1.1.8 (см. выше) [1-3], причем в разных отделах мозга их соотношение разное [10]. Так, хвостатое ядро мозга норки характеризуется наименьшей относительной активностью БХЭ (меньше 5%), в то время как для таких структур мозга, как белое вещество коры больших полушарий и зрительные бугры, активность БуХЭ составляла 20% [10]. В случае ХЭ хвостатого ядра мозга ладожского тюленя, прежде чем проводить исследование субстратно-инги-биторной специфичности ферментного препара-
та, мы сочли необходимым определить, содержит ли образец мозговой ткани одну или две ХЭ, т.е. проверить гомогенность холинэстеразной активности тестируемого препарата. Такую проверку проводят методом субстратно-ингибиторного анализа с использованием специфических эффекторов [14]. В табл. 2 представлены величины £п для трех ФОИ, измеренные с помощью различных субстратов (ацетилхолина и пропионилхолина). Следует учесть, что соединение 1 и соединение 3 являются специфическими ингибиторами соответственно БуХЭ и АХЭ. На основании данных табл. 2 видно, что величины £п практически не зависели от природы субстрата, а это свидетельствует о том, что в ткани хвостатого ядра мозга тюленя содержится только одна ХЭ.
В табл. 3 приведены сравнительные характеристики субстратной специфичности препаратов ХЭ хвостатого ядра мозга ладожского тюленя и быка, а также препарата ХЭ эритроцитов крови быка, который обычно используется в энзимологических исследованиях в качестве "реперной" АХЭ. Для сопоставления использованы непосредственно определяемые кинетические параметры ферментативного гидролиза группы холиновых субстратов (ацетилхолина, пропионилхолина, бутирилхоли-на, бензоилхолина и ацетил-Р-метилхолина): активность каталитического центра ас (в табл. 3
представлена в виде ^ ас) константа Михаэлиса КМ (представлена в виде отрицательного логарифма рКм), а также такой производный параметр, как величина отношения ас/Км (представлен как (ас/КМ)), характеризующий скорость реакции при <§ Км, позволяющий оценить величину константы скорости процесса образования комплекса Михаэлиса и тем самым в определенной мере отражающий сродство субстрата к ферменту [2, 3]. Обращает на себя внимание сходство между двумя мозговыми ХЭ и "реперной" эритроцитарной АХЭ. Во-первых, все три ферментных препарата были не способны катализировать гидролиз бутирилхолина и бензоилхолина в условиях эксперимента. Во-вторых, с наибольшей скоростью все три препарата ХЭ гидролизовали ацетилхолин, несколько медленнее пропионилхо-лин, и в 2-3 раза медленнее ацетил-Р-метилхолин.
Таблица 2. Исследование гомогенности препарата ХЭ хвостатого ядра мозга тюленя по чувствительности к различным ФОИ (^ определенной с помощью разных субстратов
№ соединения Фосфорорганический ингибитор Субстрат
ацетилхолин пропионилхолин
1 [(CH3)2CHO]2P(O)F 4.20 4.23
2 C2H5O(CH3)P(O)SC2H4SC2H5 4.74 4.70
3 C2H5O(CH3)P(O)SC2H4S+(CH3)C2H5 • CH3SO4 7.85 7.80
414
РОЗЕНГАРТ, БАСОВА
Таблица 3. Кинетические параметры субстратной специфичности ХЭ хвостатого ядра мозга ладожского тюленя, а также мозга и эритроцитов быка [6]
Источник фермента
Субстрат тюлень, мозг бык, мозг бык, эритроциты
К м К м К м
^ «0 РКм ^ «0 РКм ^ «0 РКм
Ацетилхолин 5.38 3.80 9.18 5.46 3.79 9.25 5.49 3.84 9.33
Пропионилхолин 5.30 3.74 9.11 5.32 3.75 9.07 5.37 3.79 9.16
Ацетил-Р-метилхолин 4.93 2.96 7.78 4.90 2.84 7.75 5.03 2.90 7.93
Примечание. рКм - отрицательный логарифм величины константы Михаэлиса; скорость ферментативного гидролиза бути-рилхолина и бензоилхолина при данной концентрации фермента и субстрата практически неопределима.
Таблица 4. Чувствительность ХЭ мозга тюленя и ряда других ХЭ млекопитающих [1, 2] к некоторым фосфор-органическим ингибиторам
№ соединения Фосфорорганический ингибитор ^ кп
ХЭ мозга тюленя ХЭ мозга норки ХЭ мозга быка АХЭ эритроцитов быка
1 [(СН^СНОЩО^ 4.20 4.56 4.58 4.63
2 С2Н5О(СН3)Р(О)8(СН2)28С2Н5 4.74 4.66 4.51 4.50
3 С2Н5О(СН3)Р(О)8(СН2)28+(СН3)С2Н5 ■ СЩБО; 7.85 7.86 8.68 8.52
4 С2Н5О(СН3)Р(О)Б(СН2)2С(СН3)3 3.28 - 3.45 3.48
5 С2Н5О(СН3)Р(О)Б(СН2)4С(СН3)3 3.51 - 3.52 3.86
6 С2Н5О(СН3)Р(О)Б(СН2)5С(СН3)3 3.72 - 3.71 4.00
7 С2Н5О(СН3)Р(О)Б(СН2)бС(СН3)3 3.99 - 3.90 4.28
8 С3Н7О(СН3)Р(О)БС4Н9 4.23 - - 3.74
9 С4Н9О(СН3)Р(О)БС4Н9 4.32 - - 4.15
10 С5Н11О(СН3)Р(О)БС4Н9 3.88 - - 3.82
11 С7Н15О(СН3)Р(О)БС4Н9 3.92 - - 3.65
12 С8Н17О(СН3)Р(О)8С4Н9 3.75 - - 3.63
В-третьих, симбатно скорости гидролиза менялась величина отношения ас/КМ, однако ее снижение в случае ацетил-Р-метилхолина было более существенным (в 20-25 раз). В-четвертых, абсолютные величины параметров для каждого из субстратов очень близки друг другу. В-пятых, высокие концентрации субстратов тормозили акти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.