УДК 577.352.5;57.085
ЭПИЛЕПТИФОРМНЫЕ ПОСТСИНАПТИЧЕСКИЕ ТОКИ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ НЕЙРОНОВ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫСЫ: КАЛЬЦИЕВЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ
© 2014 г. Д. А. Сибаров1, 2*, П. А. Абушик1, 2, А. Е. Большаков1, Т. В. Карелина1, 2,
И. И. Кривой3, С. М. Антонов1, 2
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, 194223, пр. Тореза, 44; *электронная почта: dsibarov@gmail.com 2Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, лаборатория молекулярной нейродегенерации, 194021, Санкт-Петербург, ул. Хлопина, 5 3Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9
Поступила в редакцию 20.07.2013 г.
Показано, что первичная культура нейронов коры головного мозга крысы является удобной моделью для изучения механизмов эпилептогенеза, в частности, эпилептиформных постсинаптических токов (ЭТ), отражающих периодический массовый асинхронный выброс глутамата. Установлено, что в первичной культуре нейронов головного мозга крысы ЭТ могут генерироваться спонтанно, либо вызываться снятием магниевого блока каналов ММБЛ-рецепторов, а также ГАМКергиче-ского торможения. ЭТ зависят от осцилляций внутриклеточного кальция, происходящих с участием ММБЛ-рецепторов, причем вторичный выход кальция из внутриклеточных депо обязателен для синхронизации ЭТ. Воздействия, вызывающие кальциевую перегрузку нейронов или снижение концентрации свободного внутриклеточного кальция, подавляют генерацию ЭТ. Так, вход кальция в нейроны при гиперактивации ММБЛ-рецепторов или при действии кальциевого ионо-фора иономицина нарушал генерацию ЭТ. Аналогичное подавление ЭТ происходило при снижении концентрации внутриклеточного кальция с помощью ВЛРТЛ, загруженного в нейроны, или путем стимуляции выведения кальция №+/Са2+-обменником с помощью уабаина в концентрации 1 нМ. Показана также частичная зависимость ЭТ от генерации потенциалов действия. Таким образом, самоподдерживающаяся генерация ЭТ в нейронах существует только в условиях периодического обратимого повышения концентрации внутриклеточного кальция в ограниченных концентрационных рамках.
Ключевые слова: эпилептиформные токи, первичная культура, нейроны, кора, кальций, уабаин.
Б01: 10.7868/80233475514010101
Онтогенез коры головного мозга эмбриона сопровождается значительными структурными перестройками нейронной сети. В этот период в мозге существует высокая вероятность развития эпилептиформной активности. Даже в более поздние сроки — в раннем постнатальном развитии — очаг эпилептической активности чаще расположен в коре [1]. В модели первичной культуры нейронов аналогичное состояние наблюдается приблизительно на 12-й день культивирования, что, вероятно, связано с тем, что в этот период нейроны характеризуются минимальной экспрессией субъединицы С1иЯ2 ЛМРЛ-рецепторов и, соответственно, высокой долей кальций-проницаемых ЛМРЛ-каналов [2, 3]. Первичная культура нейронов коры головного мозга является
удобной моделью для изучения физиологии нейронной сети. В отличие от срезов мозга культура нейронов имеет особенности, связанные с плоскостной организацией и дефицитом глиального контроля синаптической передачи [4]. Тем не менее на культуре нейронов коры и гиппокампа с помощью внеклеточной микроэлектродной регистрации была показана эпилептиформная спай-ковая активность нейронов, сходная с наблюдаемой на срезах мозга [5].
Регистрация внеклеточными микроэлектродными массивами показала, что повторяющиеся спонтанные эпилептиформные разряды в кортикальной культуре могут быть вызваны инкубированием в безмагниевый растворе в течение нескольких часов, и сохраняться в последующие не-
сколько дней [5, 6]. Кратковременное (несколько минут) снятие тормозной синаптической передачи бикукуллином также вызывает самоподдерживающуюся эпилептоподобную спайковую активность нейронов, что показано на срезах мозга [7] и тканевых эксплантатах [8].
Обе упомянутые модели инициации эпилеп-тиформной активности предусматривают периодическое возрастание концентрации внутриклеточного кальция ([Са2+]() [9]. Это может быть как прямое увеличение вероятности входа кальция через ММЭА-рецепторы, так и гиперактивация возбуждающей синаптической передачи, вовлекающая все типы кальций-проницаемых ионо-тропных рецепторов глутамата в отсутствие торможения. В нейронах [Са2+] регулируется множеством механизмов, так как является ключевым внутриклеточным сигнальным мессенджером. Так, небольшие повышения [Са2+] происходят при нормальных физиологических процессах, связанных с выбросом медиатора, изменением пластичности, долговременной потенциацией и т.п. Чрезмерное необратимое повышение [Са2+] наблюдается при эксайтотоксическом воздействии глутамата, что случается при инсультах, травмах мозга и некоторых нейродегенеративных заболеваниях. Кальциевая гипотеза эпилептоге-неза предполагает, что в основе явления эпилепсии лежит длительное субкритическое обратимое возрастание [Са2+];, приводящее к патологической нейронной активности и некоторому повышению вероятности гибели нейронов [5].
Миниатюрные возбуждающие постсинапти-ческие токи (мВПСТ) возникают в результате спонтанного выброса возбуждающего нейроме-диатора из везикул в синаптическую щель [10, 11]. Частота, амплитуда и длительность мВПСТ в первичной культуре нейронов коры зависят от концентрации свободного кальция в пресинапсе [4], которая может регулироваться неквантовой секрецией глутамата [12]. В безмагниевой среде частота и амплитуда мВПСТ больше, чем в контроле [13], что связано с увеличением квантового состава спонтанных токов [4]. Функциональные характеристики возбуждающей синаптической передачи в различных отделах головного мозга отличаются в силу различий в экспрессии подтипов глутаматных рецепторов[14]. В связи с этим возможно существование отличий в генерации постсинаптических токов разными отделами мозга. Несмотря на многочисленные исследования миниатюрных постсинаптических токов, выполненные на первичной культуре нейронов гип-покампа, работы, касающиеся постсинаптиче-ских токов в нейронах коры, единичны, а эпилептиформные постсинаптические токи в модели первичной культуры нейронов коры прежде не изучались.
В связи с этим в настоящей работе изучали роль различных механизмов регуляции внутриклеточного кальция в генерации эпилептиформ-ных постсинаптических токов в первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на первичной культуре нейронов коры большого мозга крыс линии Вистар при температуре 23—26°С. Для приготовления первичной культуры нейронов, описанной ранее [15, 16], использовали эмбрионы на 16-й день пренатального развития (Е16). Кору головного мозга эмбрионов выделяли при низких температурах на чашке Петри со льдом. Клетки культивировали в питательной среде на стеклах, предварительно обработанных поли-^-лизином. Пэтч-кламп-регистрацию постсинаптических токов проводили в конфигурации "целая клетка" на нейронах с 10-го по 16-й день культивирования (10— 16 days in vitro, DIV). В опытах использовали внеклеточный перфузионный раствор следующего состава (концентрации указаны в мМ): 140 NaCl; 2.8 KCl; 2.0 CaCl2; 1.0 MgCl2; 10 HEPES, при pH 7.2—7.4. В ряде опытов для инициации эпи-лептиформных токов из раствора был исключен Mg2+, что описано в результатах экспериментов. Кроме того, в безмагниевом растворе выполнены все эксперименты с использованием блокаторов NMDA-рецепторов. Внутриклеточный раствор для заполнения микроэлектрода имел следующий состав (мМ) 9 NaCl, 17.5 KCl, 121.5 K-глюко-нат, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 2 MgATP, 0.5 NaGTP [17]. Для регистрации токов применяли усилитель MultiClamp 700B c системой сбора данных Digidata 1440A и программное обеспечение pClamp v10.2 (Molecular Devices, США). Частота дискретизации составляла 20000 изм/с с предварительной аналоговой фильтрацией (эквивалент фильтра Бесселя 8 порядка) с частотой среза 1.4 кГц для удаления высокочастотных шумов. Позиционирование кончика микроэлектрода выполняли микроманипулятором MP-85 (Sutter Inc, США) под визуальным контролем на инвертированном микроскопе Nikon Diaphot TMD (Nikon, Япония). Для аппликации тестовых веществ использовали систему быстрой смены растворов на базе BPS-4 (Ala Scientific Instruments, США). Ниже приведены концентрации использованных реагентов: 30 мкМ NMDA (N-метил-^-аспартат, агонист NMDA-рецепторов) применялся совместно с 30 мкМ глицина; 50 мкМ AP5 ((2R) -амино - 5 - фосфопентаноат, специфический антагонист NMDA-рецепторов); 30 мкМ CNQX (6-циано-7-нитрокиноксалин-2.3-дион, антагонист AMPA-каинатных рецепторов); 20 мкМ би-кукуллин (антагонист рецепторов типа А у-ами-номасляной кислоты, ГАМКа); 0.5 мкМ тетродо-
токсин (TTX, блокатор натриевых каналов), 1 нМ уабаин (специфический лиганд №+,К+-АТР-азы), 2 мкМ иономицин (кальциевый ионофор), 2—5 мкМ BAPTA-AM (мембранопроницаемая форма внутриклеточного кальциевого хелатора BAPTA). Все среды для приготовления культур ткани приобретены в фирме Биолот (Россия); остальные вещества поставлены фирмой Sigma Aldrich (США).
Детекцию постсинаптических токов, а также анализ их частоты выполняли в программе Clampfit 10.2, входящей в пакет pClamp.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На 12-й день культивирования и позднее на некоторых нейронах коры в первичной культуре удавалось зарегистрировать спонтанно возникающие волны возбуждения, связанные с периодическим массовым выбросом медиатора, что приводило к возникновению входящих токов очень высокой амплитуды (пик мог достигать 5 нА) (рис. 1) с фазой спада, достигающей 5 с. Подобные токи регистрируются в мотонейронах при раздражении дорзальных корешков [18], т.е. при синхронной активации множества синаптических входов. В культуре нейронов коры генерация таких волн возбуждения наблюдалась как в перфузион-ном растворе, содержащем магний (рис. 1а), так и в безмагниевом растворе (рис. 1б). Следует заметить, что вероятность регистрации этих высокоамплитудных токов в безмагниевом растворе существенно возрастала. Такие постсинаптические токи (ЭТ) носили периодический характер и являлись
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.