научная статья по теме ESR - РЕТИНАЛЬНЫЙ БЕЛОК EXIGUOBACTERIUM SIBIRICUM С НЕОБЫЧНЫМИ СВОЙСТВАМИ (ОБЗОР) Химия

Текст научной статьи на тему «ESR - РЕТИНАЛЬНЫЙ БЕЛОК EXIGUOBACTERIUM SIBIRICUM С НЕОБЫЧНЫМИ СВОЙСТВАМИ (ОБЗОР)»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 814 - 828

УДК 577.112+577.34

ESR - РЕТИНАЛЬНЫЙ БЕЛОК Exiguobacterium sibiricum С НЕОБЫЧНЫМИ СВОЙСТВАМИ

Обзор

© 2015 Л.Е. Петровская1*, С.П. Балашов2, Е.П. Лукашев3, Е.С. Имашева2, И.Ю. Гущин4 5 6,7,8, А.К. Дюмаев2, А.Б. Рубин3, Д.А. Долгих13, В.И. Горделий4,5 6 7 8, Я.К. Лани2, М.П. Кирпичников13

1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва; факс: +7(495)330-6983, электронная почта: lpetr65@yahoo.com

2 Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 92697, USA

3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва

4 Institut de Biologie Structurale, Universite Grenoble Alpes, 38044 Grenoble, France

5 Institut de Biologie Structurale, Centre National de la Recherche

Scientifique, 38044 Grenoble, France

6 Institut de Biologie Structurale, Direction des Sciences du Vivant,

Commissariat a l'Energie Atomique, 38044 Grenoble, France

7 Московский физико-технический институт, Лаборатория

перспективных исследований мембранных белков, 141700Долгопрудный Московской обл.

8 Institute of Complex Systems (ICS), ICS-6: Structural Biochemistry, Research Centre Julich, 52425 Julich, Germany

Поступила в редакцию 12.01.15 После доработки 10.03.15

Рассмотрены свойства ретинального белка (ESR) психротрофной бактерии Exiguobacterium sibiricum, представляющего собой светозависимую протонную помпу. Уникальной структурной особенностью ESR является наличие остатка лизина в положении, соответствующем внутрибелковому донору протонов для основания Шиффа. Мы показали, что Lys96 успешно выполняет в молекуле ESR функцию донора, облегчая доставку протонов с цитоплазматической поверхности белка к основанию Шиффа. Поскольку поглощение протонов предшествует репротонированию основания Шиффа, можно предположить, что в исходном состоянии этот остаток не заряжен и приобретает протон в течение короткого промежутка времени после де-протонирования основания Шиффа и образования интермедиата М. Это отличает ESR от родственных ре-тинальных белков — бактериородопсина (BR), протеородопсина (PR) и ксантородопсина (XR), в которых функцию донора выполняют остатки с карбоксильной группой, протонированные в исходном состоянии. Как и другие протонные помпы эубактерий (PR и XR), ESR содержит остаток гистидина, взаимодейству-щий с акцептором протонов Asp85. Это взаимодействие приводит к сдвигу рКа акцептора в более кислую область по сравнению с PR, обеспечивая его способность к функционированию в широком диапазоне рН. Наличие сильной водородной связи между остатками Asp85 и His57, структура вероятных протонперенося-щих путей с цитоплазматической поверхности к основанию Шиффа и к наружной поверхности и другие особенности ESR продемонстрированы благодаря расшифровке его пространственной структуры, которая выявляет ряд отличий от известных структур BR и XR. Структура ESR, схема фотоцикла и реакций переноса протонов обсуждаются в сравнении с гомологичными ретинальными белками.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ретинальный белок, протеородопсин, Exiguobacterium sibiricum, основание Шиффа, акцептор протонов, донор протонов, фотоцикл.

Принятые сокращения: ESR — ретинальный белок Exiguobacterium sibiricum; BR — бактериородопсин Halobacterium salinarum; PR — протеородопсин; XR — ксантородопсин Salinibacter ruber; GR — ксантородопсин Gloeobacter violaceus; GPCR — рецепторы, сопряженные с G-белками; ДДМ — п-додецил^-О-мальтопиранозид; LPG — 1-пальмитоил-2-гид-рокси-8п-глицеро-3-фосфо-Г-гас-глицерин.

* Адресат для корреспонденции.

В 2008 г. в BMC Genomics была опубликована статья, посвященная расшифровке генома Exiguobacterium sibiricum — микроорганизма, выделенного из вечномерзлого грунта возрастом ~3 млн лет. На основании аннотации кодирующих последовательностей в ней было высказано предположение о том, что эта психротрофная бактерия может продуцировать родопсин [1]. Экспрессия соответствующего гена в E. coli продемонстрировала функциональное сходство ре-комбинантного родопсина с другими ретиналь-ными белками — переносчиками протонов [2]. К этому моменту прошло уже около 40 лет после открытия первого протонного насоса такого рода — бактериородопсина (BR) пурпурных мембран галофильных архей Halobacterium salinarum [3]. За эти годы были опубликованы сотни работ, посвященных расшифровке механизма, с помощью которого энергия поглощенного кванта света преобразуется молекулой этого белка в электрохимический градиент протонов на мембране.

Важнейшими вехами на этом пути стали определение аминокислотной последовательности BR [4, 5], доказательство электрогенности переноса протонов [6, 7], определение пространственной структуры белка [8, 9], разработка системы мутагенеза в H. salinarum [10], получение данных рентгеноструктурного анализа высокого разрешения [11]. Было установлено, что каждая молекула BR состоит из двух компонентов: бел-ка-опсина и хромофора — all-trans-ретиналя, связанного с остатком Lys216 через Шиффово основание [4]. После поглощения света происходит изомеризация ретиналя в ü-cis-конфигу-рацию [12, 13] с образованием короткоживуще-го состояния (интермедиата) К [14, 15]. В результате последующих конформационных изменений хромофора, заканчивающихся его возвращением в all-trans-конфигурацию, и сопровождающих их структурных перестроек белка, которые характеризуются образованием интер-медиатов L, M, N и О, происходит освобождение протона на внешней поверхности белка и его поглощение с цитоплазматической поверхности [16].

Ключевым событием в фотоцикле BR является перенос протона с основания Шиффа на акцептор — остаток Asp85 [17], сопровождаемый образованием интермедиата М (депротониро-ванного основания Шиффа). Показано, что принципиальное значение для функционирования белка имеет система водородных связей, соединяющая акцептор протона Asp85 и соседние остатки (Arg82, Asp212 и другие) [11]. Репрото-нирование основания Шиффа осуществляется с участием внутрибелкового донора — остатка

Азр96 [18]. Продемонстрировано, что транспорт протона является результатом последовательных изменений рКа основания Шиффа и ключевых аминокислотных остатков в результате конформационных перестроек [19]. Пространственные структуры различных интермедиатов BR были исследованы с помощью метода рентгеновской кристаллографии при низких температурах [20—22]. В целом в настоящее время BR является одним из наиболее изученных мембранных белков.

В 2000 г. семейство ретиналь-содержащих белков пополнилось протеородопсином (PR), ген которого был открыт в результате секвени-рования метагеномной библиотеки, полученной из морского микропланктона [23]. Оказалось, что «зеленый» (названный по положению максимумом поглощения) протеородопсин (GPR) проходит те же основные стадии фотоцикла, которые характерны и для BR, однако рКа первичного акцептора Азр97 в его молекуле существенно выше (7,5 против 2,5 у BR). Кроме того, выделение протона молекулой PR происходит во второй части фотоцикла, после его поглощения из цитоплазмы.

Впоследствии было обнаружено существование огромного количества структурных аналогов BR у протеобактерий, актиномицетов, циа-нобактерий, грибов и других микроорганизмов [24]. Аминокислотные последовательности всех этих белков обладают определенной степенью гомологии, при этом ключевые позиции в них занимают те же аминокислотные остатки, что и в BR, или гомологичные остатки с аналогичными функциональными группами. Так, акцептором протонов в молекулах всех транспортных родопсинов является аспартат, а функцию донора протонов выполняет аспартат или глутамат. Таким образом, обнаружение гена нового рети-нального белка в 2008 г. уже не являлось сенсацией, и нужны были веские причины, чтобы начать работу по его получению и исследованию.

Таких причин оказалось две. Во-первых, интерес представляло наличие кодирующей последовательности ретинального белка (мы назвали его ESR от Exiguobacterium зШпсит гИоёор8т) в геноме психротрофной почвенной бактерии [2]. Все ранее известные микробные родопсины принадлежали галофильным археям или морским микроорганизмам, а Е. зШпсит была выделена из грунта, имеющего пресноводное происхождение. Во-вторых, сравнение аминокислотных последовательностей ESR, BR и PR выявило консервативный характер всех ключевых аминокислотных остатков, предположительно участвующих в транспорте протона, за исключением одного. В положении, соответствующем

донору протонов для основания Шиффа, вместо привычного карбоксильного остатка в молекуле ESR обнаруживается остаток лизина (Ьу896) (рис. 1). Позднее этот остаток в соответствующем положении был обнаружен у протеородоп-синов родственных видов, например, Exi-guobacterium АТ1Ь, обитающей в горячем источнике в Йеллоустонском парке [25], а также у потенциальных ретинальных белков океанских протеобактерий [26]. Наличие такой уникальной структурной особенности вызвало ряд вопросов, на которые отвечали в процессе исследований этого интереснейшего ретинального белка.

ОСОБЕННОСТИ ФОТОЦИКЛА ESR В РАЗЛИЧНЫХ СРЕДАХ И ЕГО СВЯЗЬ С ВЫДЕЛЕНИЕМ ПРОТОНА

Рекомбинантный ESR с гексагистидиновой последовательностью на С-конце был экспрес-сирован нами в Escherichia coli, экстрагирован из мембранной фракции клеток бактерий в присут-

ствии детергента п-додецил^-В-мальтопира-нозида (ДДМ) и очищен с помощью металлоаф-финной хроматографии [2]. При рН 7 спектр поглощения полученного препарата демонстрировал максимум при 532 нм (рис. 2, а), короче, чем у BR и XR, и ближе к максимуму поглощения GPR. Для доказательства протон-транспортной активности ESR были изучены светоинду-цированные изменения рН в суспензии протео-липосом со встроенным белком или экспресси-рующих его клеток E. coli. В ответ на освещение происходило закисление раствора, что соответствует переносу протонов наружу из клеток или протеолипосом, содержащих ESR (рис. 2, б). Работа протонной помпы наблюдалась в широком диапазоне рН — между 4,5 и 8,5. На основании полученных данных был сделан вывод о том, что новый ретинальный белок является пред

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»