научная статья по теме ЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ТРИПСИНА В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ Химия

Текст научной статьи на тему «ЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ТРИПСИНА В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ»

БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 5, с. 660 - 665

УДК 577.15.03

ЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ТРИПСИНА В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ

© 2006 г. Е.А. Ступишина, Р.Н. Хамидуллин, Н.Н. Вылегжанина, Д.А. Файзуллин, Ю.Ф. Зуев*

Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦРАН, 420111 Казань, а/я30; факс: (8432)292-7347, электронная почта: zuev@mail.knc.ru

Поступила в редакцию 10.06.05 После доработки 20.09.05

Изучена температурная зависимость действия этиленгликоля (ЭГ) на кинетику реакции гидролиза N-a-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира, катализируемую трипсином, включенным в обращенные мицеллы на основе бис-(2-этилгексил)-сульфосукцината натрия (АОТ). Показано, что ЭГ расширяет диапазон активности трипсина в обращенных мицеллах в сторону более высоких температур. Данные ИК-спектроскопии свидетельствуют о стабилизирующем влиянии ЭГ в системе обращенных мицелл на вторичную структуру белка. Методом ЭПР спиновых зондов установлено, что солюбилизированный белок провоцирует изменения во взаимодействии ЭГ с полярными головными группами АОТ и вызывает изменение жесткости ми-целлярной матрицы. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что в микроэмульсионных средах ЭГ может повышать термостабильность солюбилизированного фермента по двум механизмам.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: обращенные мицеллы, этиленгликоль, трипсин, термостабильность.

Известно, что сахара, аминокислоты, ряд солей [1, 2], полиолы [3, 4] увеличивают термостабильность белков, причем максимум их ферментативной активности наблюдается при более высоких температурах. Полиэтиленгликоли различной молекулярной массы (в том числе ЭГ [4]) дегидратируют белок и связываются с его поверхностью. При повышении температуры при частичном разворачивании белка эти соединения взаимодействуют с гидрофобными участками белка, экспонированными на поверхности, и замедляют процесс его дальнейшего плавления.

Такие изменения в свойствах белков обнаружены in vitro в условиях, существенно отличающихся от условий их природного функционирования. Системой, позволяющей моделировать природную иммобилизацию ферментов и их микроокружение, является дисперсия обращенных мицелл [5]. Многие ферменты в системах обращенных мицелл демонстрируют значительную стабильность и высокую активность, хотя

Принятые сокращения: ЭГ — этиленгликоль, БАЭЭ — М-а-бензоил-Ь-аргинин-этиловый эфир, АОТ — бис-(2-этилгексил)-сульфосукцинат натрия, ЭПР — электронный парамагнитный резонанс, ПАВ — поверхностно-активное вещество.

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

по сравнению с водной средой могут проявлять специфические особенности. Мицеллярная эн-зимология [6] объединяет различные аспекты исследования ферментов в микроэмульсиях (трехкомпонентных системах вода-поверхностно-активное вещество (ПАВ)-органический растворитель), в том числе и поиск факторов повышения термостабильности ферментов. Система, представляющая собой фермент, со-любилизированный в микроэмульсии, является единым каталитическим ансамблем, в котором за активность фермента отвечают и его собственное структурное состояние, и динамическая структура реакционной среды.

В литературе [7, 8] приводятся данные о влиянии различных добавок, в том числе смешивающихся с водой органических растворителей, на структуру обращенных мицелл. Методом кондуктометрии показано, что этиленгликоль (ЭГ) дестабилизирует структуру монослоя бис-(2-этилгексил)-сульфосукцината натрия (АОТ) мицелл [8]. Аналогичный вывод сделан на основании данных ЭПР, показавших, что молекулы ЭГ взаимодействуют с полярными головными группами АОТ и встраиваются между ними [9]. При этом плотность упаковки углеводородных цепей молекул АОТ уменьшается. Также имеются публикации, в которых приводятся данные о влиянии полярных органических жидкостей на

каталитическую активность ферментов, помещенных в обращенные мицеллы на основе АОТ [10, 11]. Установлено, что частичная замена воды в обращенных мицеллах на глицерин в несколько раз повышает каталитическую активность а-химотрипсина [12]. Авторы объясняют это более глубоким снижением конформацион-ной подвижности белковой структуры в присутствии глицерина в условиях геометрического соответствия размеров внутренней полости обращенной мицеллы и молекулы белка.

Цель данной работы — изучение факторов влияния этиленгликоля на температурную стабильность трипсина, солюбилизированного в системе обращенных мицелл.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовался трипсин из поджелудочной железы свиньи фирмы «Sigma» (США) (ЕС 3.4.21.4, тип IX-S, Т-0303) и специфический гидрофильный субстрат N-a-бензоил-Ь-арги-нин-этиловый эфир (БАЭЭ) этой же фирмы. Обращенная микроэмульсия готовилась на основе анионного ПАВ—АОТ (MP «Biomedicals, Inc.», Германия), концентрация которого в объеме микроэмульсии составляла 0,3 М. В качестве дисперсионной среды использовался «-декан, в качестве водной фазы — 0,05 М Tris-HQ-буфер, рН 8,5. Задавались степени гидратации мицелл с молярным отношением [вода]/[АОТ] = W0 = 12—20. В экспериментах с этиленгликолем проводилось замещение части водной фазы на ЭГ (до 30% всего объема).

Концентрации фермента (Е0) и субстрата (S0) составили 0,7-1,0 мкМ и 0,45-1,0 мМ и контролировались соответственно на полосах поглощения 280 (поглощение Е1% 1см = 14 [13]) и 228 нм (коэффициент поглощения в 10 700 М-1 • см-1). Концентрации фермента и субстрата рассчитывались для всего объема реакционной среды. Кинетические измерения проводились на спектрофотометре Specord М 40 («Carl Zeiss, Jena», Германия) на полосе поглощения продукта гидролиза БАЭЭ 256 нм. Начальная скорость реакции (V0) определялась по наклону линейной части кривой накопления продукта во времени в течение 30-40 с после начала реакции. Значение V0 определяли по формуле V0 = D/АвШ (l = 0,5 см -толщина кюветы, D - оптическая плотность в максимуме полосы поглощения, для продукта гидролиза БАЭЭ в системе обращенных мицелл Ав = 1600 М-1 • см-1 [14], где Ав - разностный молярный коэффициент поглощения). Перед проведением реакции концентрированный раствор фермента хранился на льду в течение 5 ч.

Затем его (5 мкл) вносили в измерительную кювету, где выдерживали 10 мин при каждом значении температуры. Реакция гидролиза БАЭЭ инициировалась субстратом, который вносился в виде концентрированного раствора (5 мкл) в измерительную кювету (объем реакционной среды 1 мл). Измерения проводились при 15—45°.

Вторичная структура трипсина контролировалась с помощью ИК-Фурье-спектрофотомет-ра Vector-22 («Bruker») при спектральном разрешении 4 см-1. Спектры записывались после 64 накоплений. Измерения проводились при 20-60° в термостатируемых кюветах из СаF2 толщиной 10 и 100 мкм. Обработка спектров, включая вычисление второй производной, проводилась с помощью программы OPUS, входящей в комплект программного обеспечения спектрофотометра. Компоненты спектра к элементам вторичной структуры относили на основе известных корреляций [15]. При спектроскопических исследованиях использовалась 0,25%-ная (по объему микроэмульсии) концентрация белка.

Исследования динамической структуры монослоя АОТ были выполнены методом ЭПР спинового зонда, в качестве которого использовалась 4-(2-н-ундецил-3-оксил-4,4-диметил-2-оксазолидин-2-ил)-масляная кислота. Благодаря амфифильному строению подавляющее число молекул зонда локализуется в монослое молекул АОТ, формирующих оболочку мицеллы, предоставляя информацию об упорядоченности упаковки молекул АОТ (максимальное сверхтонкое расщепление в спектрах 2Amax), о подвижности углеводородных цепей молекул АОТ (время корреляции вращательного движения зонда т) и о полярности микроокружения парамагнитного фрагмента зонда (константа сверхтонкого расщепления aN) [16]. Регистрация спектров проводилась на радиоспектрометре РЭ-1306 (СССР) при 10-60°.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор фермента (трипсин) обусловлен тем, что для него, как и для a-химотрипсина, лакказы и биназы, лимитирующая стадия каталитического процесса не связана с конформационными превращениями [17-21]. Константа скорости реакции не зависит от вязкости раствора почти до 18 сПз. Такие ферменты осуществляют катализ по типу «напряженного» субстрата [22]. Поэтому при частичной замене воды на ЭГ влиянием вязкости среды в водном ядре мицелл на скорость каталитической реакции можно пренебречь.

В микроэмульсионной среде максимум ферментативной активности сдвинут вниз по тем-

пературе на 20—25° по сравнению с буферным раствором [23]. Это объясняется существенным изменением физико-химических свойств микроокружения фермента. Повышение температуры приводит к увеличению степени диссоциации головных групп АОТ, возрастанию связывания катионного субстрата с отрицательно заряженной поверхностью мицелл и, как следствие, уменьшению его концентрации в зоне реакции [24]. Нельзя исключать и ингибирующего действия ионов концентрация которых в водной фазе микроэмульсии увеличивается с ростом степени диссоциации АОТ при повышении температуры. Все вышеперечисленные факты свидетельствуют о заметном снижении скорости реакции по сравнению с буферным раствором.

На рис. 1 приведены графики, отражающие соотношение ферментативной активности трипсина в двух микроэмульсионных средах, отличающихся размером обращенных мицелл. Уровень активности трипсина до температурного максимума в мицеллах с W0 = 12 несколько выше такового при Ж0 = 20. Это согласуется с «принципом геометрического соответствия» [6, 25], согласно которому в условиях равенства диаметра внутренней полости обращенной мицеллы и размера молекулы включенного белка наблюдается более высокий уровень каталитической активности. Действительно, при среднем радиусе молекулы трипсина ~2,0 нм принцип

Рис. 1. Температурная зависимость начальной скорости гидролиза БАЭЭ в обращенных мицеллах с различной степенью гидратации и с заменой части водной фазы на ЭГ: W0 = 12 (1 - контроль, 2 - 15%-ный (V/V) ЭГ) и 20 (3 -контроль, 4- 15%-ный ЭГ (V/V)). CAOT = 0,3 M, CE = 0,7 мкМ, СБаээ = 0,53 мМ

см-1

Рис. 2. Вторая производная спектров поглощения трипсина в буфере (1) и 13%-ном буферном растворе ЭГ (2) при 20°

геометрическог

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком