БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 6, с. 742 - 753
УДК 576.385.5
ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ВЕКТОРЫ И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ ДЛЯ ТЕРАПИИ РАКА
Обзор
© 2006 г. Е.М. Глинка*, Э.Ф. Эдельвейс, С.М. Деев
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)335-7103, электронная почта: em_glinka@mail.ru
Поступила в редакцию 19.09.05 После доработки 21.10.05
Рассмотрены способы придания специфичности терапевтическим антираковым агентам: транскрипционная активация ткане- и опухолеспецифичных промоторов в эукариотических экспрессирующих векторах и использование противоопухолевых иммуноконъюгатов. Проанализирована стратегия выбора адресно-транскрибируемых промоторов и приведены примеры слитных иммунобелков для антираковой терапии. Изложены имеющиеся в литературе данные нового направления, объединяющего методы генотерапии и терапии с использованием антител. Это направление основано на создании векторов, экспрессирующих сек-ретируемые иммуноконъюгаты. После введения вектора в клетку, она способна синтезировать и секретиро-вать слитный белок, содержащий терапевтический антираковый агент и антитело, придающее специфическую направленность слитного белка к раковым клеткам.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: генотерапия, вектор, гибридный белок, секретируемый белок, иммуноконъюгаты, антираковый агент.
Одним из приоритетных направлений генотерапии является создание векторов, способствующих подавлению раковых опухолей. Наиболее важную роль в целенаправленной генотерапии рака играют контролируемая доставка терапевтического гена к раковым тканям и регуляция экспрессии трансгенов. Для доставки терапевтического гена используются векторы вирусной и невирусной природы. Вирусные векторы представлены дефектными по репликации ретровирусами, аденовирусами и рядом других вирусов. Ретровирусные векторы эффективно инфицируют только делящиеся клетки-мишени. Аденовирусные векторы трансдуцируют как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Они не интегрируются в геном хозяина, поэтому обеспечивают лишь кратковременную экспрессию гена [1, 2]. Плазмидная ДНК также не встраивается в геном хозяина и обеспечивает только временную экспрессию гена [3]. Она может быть непосредственно трансфицирована в клетки с помощью прямых инъекций [4], в комплексе с липо-сомами [5] или баллистической трансфекцией непосредственно в орган-мишень [6]. Экзогенная регуляция продолжительности и уровня экспрес-
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
сии терапевтического гена обеспечивается наличием индуцибельных промоторов в векторах, таких как промоторы, индуцируемые ионизирующей радиацией [7], эстрогеном [8], ионами тяжелых металлов [9]. Созданная экспрессионная система, контролируемая тетрациклином (TetOff и Tet-On), имеет ряд преимуществ по сравнению с другими экспрессионными системами: хорошая регуляция, высокая индуцибельность и быстрое время ответа [10, 11]. Эта экспрессион-ная система является контролируемой не только in vitro, но также in vivo [12].
Стратегия выбора терапевтических генов исходит из понимания молекулярной биологии рака, комплексных взаимодействий между опухолевыми клетками и иммунной системой. Для подавления раковых опухолей в конструкции встраивают гены, экспрессия которых в клетке приводит ее к гибели или стимулирует иммунный ответ. Суицидальная генотерапия злокачественных опухолей требует эффективного переноса гена и высокоселективной экспрессии генов [13]. Адресная доставка терапевтического агента может быть осуществлена путем использования тканеспецифичных или опухолеспеци-фичных промоторов, а также с помощью антител. В настоящее время созданы различные век-
торы и иммуноконъюгаты, предназначенные для терапии рака.
В данной работе представлен обзор эукарио-тических экспрессирующих векторов, конструируемых для селективного уничтожения раковых клеток. Описываются две основные стратегии направленной доставки терапевтического агента: первая - использование ткане- и опухолеспе-цифичных промоторов, вторая - использование антител. Возможно комбинирование этих двух стратегий путем создания векторов, экспресси-рующих секретируемые гибридные белки, состоящие из антитела и терапевтического белка.
СТРАТЕГИЯ ВЫБОРА АДРЕСНО-ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ ПРОМОТОРОВ
Транскрипционная активация тканеспеци-фичных и опухолеспецифичных промоторов в определенных тканях придает векторам направленность воздействия и приводит к селективному уничтожению раковых клеток при транскрипции мРНК терапевтических генов. Одно из основных ограничений тканеспецифичных промоторов такого типа в том, что экспрессия трансгена может привести к токсическому эффекту как в раковых, так и в нормальных тканях. Поэтому использование таких промоторов возможно для органов и тканей, не являющихся критичными для выживания, например, для простаты, меланоцитов, щитовидной железы. Если ткань или орган являются жизненно важными, трансген должен быть доставлен непосредственно в опухолевые клетки с помощью ретро-вирусных векторов. Так, например, тканеспеци-фичный промотор гена альбумина включается в клетках печени [14-16]. Ретровирусные векторы менее эффективны при инфицировании неделя-щихся, медленно пролиферирующих нормальных гепатоцитов, чем при инфицировании раковых клеток печени [17]. Для экспрессии терапевтического гена в альвеолярных клетках II типа и бронхиальных клетках используется промотор сурфактантного белка В [18, 19], для экспрессии в меланоцитах —промотор гена тирозиназы [2022], для экспрессии в щитовидной железе — промотор гена тироглобулина [23-25], для экспрессии в яичнике используется специфичный для яичника промотор ОБР-1 [26, 27].
Идеально, когда тканеспецифичный промотор является также и опухолеспецифичным. Опухолеспецифичные промоторы высокоактивны в раковых клетках и имеют слабую активность или неактивны в нормальных клетках. Например, такие промоторы как промотор гена,
кодирующего специфичный для простаты антиген (PSA) [28—31], промотор гена остеокальцина высокоактивны только в раковых клетках простаты [32]. Теломераза высокоактивна в большинстве раковых клеток, но не в нормальных клетках [33, 34]. Промотор гена каталитической субъединицы теломеразы человека используется в направленной генотерапии клеточной линии рака яичника [35]. Промотор гена ингибитора секреторной лейкопротеазы (SLPI) высокоактивен в эпителиальных злокачественных опухолях [36], промотор человеческого хорионного го-надотропина (hCG-P) - при тестикулярном раке [37, 38], MUC1/DF3 - при раке молочной железы, поджелудочной железы [39, 40], желудка [41] и холангиокарциномах [42], HER2/neu - при раке молочной железы [43, 44], яичника [45].
Экспрессия трансгена, ограниченная щитовидной железой. Промотор гена тироглобулина (TG). Тироглобулин является водорастворимым гликопротеидом, участвующим в депонировании и синтезе гормонов щитовидной железы. Промотор гена тироглобулина используется для тканеспецифичной экспрессии в тироидных клеточных линиях. Почти 100% клеток карциномы щитовидной железы и только 5% контрольных клеток погибали от ганцикловира (GCV) при введении в клетки аденовируса, экспрессирующего HSV-tk (тимидинкиназа из вируса Herplex simplex) под контролем тирогло-булинового промотора [23]. Тимидинкиназа — дезоксирибонуклеозид киназа (Тк) фосфорили-рует тимидин, дезоксицитидин, дезоксиуридин, а также антивирусные и антираковые аналоги нуклеозидов [46]. Тк фосфорилирует нетоксичный GCV, аналог нуклеозида, до нуклеотида (GCV-P). Затем эндогенные киназы добавляют к GCV-P два дополнительных фосфата, образуя ганцикловиртрифосфат (GCV-P-P-P). Кроме этого GCV-P может проникать в соседние клетки, в которых он также фосфорилируется эндогенными киназами. Ганцикловиртрифосфат может включаться в ДНК, но ДНК-полимераза не может реплицировать ДНК, содержащую GCV-P-P-P. В результате митоз прерывается, клетка погибает. Поскольку GCV-P может транспортироваться в соседние клетки, нет необходимости во введении вектора в каждую клетку, чтобы убить их [47]. Аденовирус, содержавший HSV-tk под контролем тандемно-повторенного минимального тироглобулинового промотора (Ad2xTG-tk), примерно в 10—30 раз более эффективно уничтожал как клетки нормальной щитовидной железы крысы (FRTL5), продуцирующие тироглобулин, так и клетки фолликулярной тироидной карциномы (FTC-133), чем аденовирус с минимальным TG промотором (AdTG-tk). Бестимус-
ные мыши, несущие клетки человеческой фолликулярной тироидной карциномы (FTC-133), обработанные Ad2xTG-tk, продемонстрировали большую редукцию опухоли и выживаемость мышей, чем при обработке AdTG-tk [48].
Экспрессия трансгена, ограниченная простатой. Промотор гена простатоспецифического антигена (PSA). PSA является внутриклеточным гликопротеином c молекулярной массой 34 кДа, синтезируемым только клетками простаты. Его экспрессия регулируется андрогенами. Уровень PSA в сыворотке увеличивается при карциноме простаты. Было продемонстрировано, что промотор гена PSA может включать экспрессию ре-портерного гена в клеточных линиях (LNCaP), продуцирующих PSA, но не в контрольных клеточных линиях, непродуцирующих PSA, таких как DU145 и PC-3 [28]. Для комбинирования свойств клеточной специфичности и высокого уровня регулируемости экспрессии трансгена был создан сложный аденовирусный вектор. Аденовирусный вектор с промотором/энхансе-ром PSA увеличивает экспрессию терапевтического гена в клеточных линиях LNCaP в 20 раз, по сравнению с PSA-негативными клеточными линиями. Тандемная дупликация энхансера PSA увеличивает экспрессию в 50 раз, а при индукции андрогеном дигидротестостероном в 100 раз [49]. Дифференциальная экспрессия продукта желаемого гена в тканях-мишенях является центральной концепцией генотерапии. Один из подходов для дифференциальной экспрессии продукта — использование тканеспецифичного промотора для включения транскрипции терапевтического гена. Ген супрессора опухоли р53 поврежден во многих видах раковых клеток. Р53-мутации — одно из наиболее частых генетических изменений при раке, поэтому введение неповрежденного гена в опухолев
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.