БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 3, с. 426 - 433
УДК 577.212.3
ЭВОЛЮЦИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ i У ЭУКАРИОТ
© 2008 г. А.В. Макарова*, В.З. Тарантул, Л.В. Генинг
Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, 2; факс: (499)196-0221, электронная почта: amakarova-img@yandex.ru
Поступила в редакцию 06.07.07 После доработки 18.09.07
Анализ ферментативной активности ДНК-полимеразы i (Pol i) в тканях разных классов позвоночных животных показал, что некорректную активность этого фермента можно обнаружить только у млекопитающих и что она полностью отсутствует у организмов, стоящих на более низких ступенях развития. Сделано предположение, что появление у млекопитающих некорректной активности Pol i связано с изменением структуры активного центра. Обсуждаются возможные функции склонной к ошибкам Pol i у высших эукариот.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДНК-полимераза i, некорректная активность, гипермутагенез.
У археев, прокариот и эукариот наряду с ДНК-полимеразами, которые обеспечивают правильную репликацию ДНК, существует около двух десятков ДНК-полимераз, основной функцией которых является, по-видимому, участие в репликации при прохождении поврежденных участков. Эффективно копируя поврежденную ДНК, эти ферменты при синтезе новых цепей ДНК склонны включать основания, не всегда руководствуясь правилом Уотсона-Кри-ка. В результате частота ошибок на неповрежденной ДНК возрастает до 10-1-10-3 [1-5]. Эти ферменты также обладают способностью катализировать присоединение азотистых оснований к аберрантным праймерным концам (не спаренным, содержащим ошибки и поврежденные участки ДНК). За такое отличие от других ДНК-полимераз, участвующих в репликации и репарации, эти ферменты были названы «error-prone» (склонными к ошибкам) ДНК-полиме-разами. В последнее время появляется все больше данных о том, что в норме склонные к ошибкам ДНК-полимеразы могут не только участвовать в репликации поврежденной ДНК в клетке, но и выполнять некоторые другие функции, обеспечивающие селективное преимущество организмов.
Открытая в 2000 г. ДНК-полимераза i (Pol i) [2, 5, 6], обнаруженная только у высших эукариот, начиная с насекомых [7], занимает особое место среди этих необычных ферментов. Последовательность Pol i сходна с последователь-
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ностью другой «ошибочной» ДНК-полимеразы Pol п [6]. Предполагается, что Pol i произошла от Pol п за счет генетической дупликации миллионы лет назад, незадолго до появления насекомых [7].
Благодаря особому строению каталитического центра и использованию не уотсон-криков-ского, а хугстиновского взаимодействия, Pol i человека обладает набором необычных свойств. Так, Pol i способна выполнять некоторые функции, направленные на сохранение стабильности генома. Например, Pol i человека может удалять фосфат дезоксирибозы (5'-дезоксирибонуклеаз-ная активность), что необходимо для правильного восстановления поврежденного участка ДНК при эксцизионной репарации оснований [8]. Pol i человека способна также вставлять гуанин напротив урацила, что может быть использовано клеткой для предотвращения транзиций, вызываемых дезаминированием цитозина [9, 10]. Наконец, этот фермент способен вести синтез напротив целого ряда повреждений ДНК с различной эффективностью и степенью корректности (АП-сайты, разнообразные аддукты пури-новых оснований и др.).
В то же время Pol i человека обладает самой низкой точностью синтеза неповрежденной ДНК среди всех известных сегодня ДНК-поли-мераз [11]. При этом включение новых нуклео-тидов напротив четырех оснований ДНК происходит с различной точностью и эффективностью. Напротив тимидина матрицы фермент встраивает dGTP (по тому же механизму, что и встраивание напротив урацила) в несколько раз эффективнее, чем канонический dATP [6]. На-
против пуринов матрицы Pol i осуществляет более точный и эффективный синтез, чем напротив пиримидинов [2, 5, 6, 12].
Обращает на себя внимание тот факт, что если свойства всех ДНК-полимераз in vitro у представителей разных классов организмов, у которых найдена та или иная ДНК-полимераза, как правило, похожи, то свойства Pol i — исключение. Известно, что у дрозофилы этот фермент по своим свойствам мало отличается от своего гомолога Pol п и не демонстрирует такой высокой склонности к ошибкам. Pol i плодовой мушки дрозофилы более похожа по своим свойствам на Pol п человека или дрожжей, чем на человеческую Pol i. Например, Pol i дрозофилы, как и Pol п эукариот, точна и эффективна на cis-syn-тиминовых димерах, а Pol i человека в этом случае ошибочна и неэффективна [7,13].
Известно, что Pol i у мышей обладает теми же свойствами, что и аналогичный фермент у человека [14, 15]. Однако пока остаются неясными свойства Pol i у представителей других позвоночных животных, хотя последовательности генов этой полимеразы уже расшифрованы у нескольких организмов (Drosophila melano-gaster, Danio rerio, Ictaluruspunctatus, Xenopus tropicalis, Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Homo sapiens, Pan troglodytes). Остаются не ясными до конца функции фермента и у человека, так как не описаны какие-либо заболевания человека, тесно связанные с мутацией в гене Pol i. В этой ситуации изучение эволюции структуры и свойств этого фермента во многом могло бы помочь уточнению ее функций у человека и млекопитающих.
Pанее нами был предложен вариант метода определения биохимической активности Pol i в грубых экстрактах различных тканей и органов животных [16, 17]. Возможность оценить активность Pol i в грубых экстрактах клеток предоставила уникальная способность фермента преимущественно встраивать dGTP напротив T матрицы, даже в условиях избытка в реакционной смеси dATP. В настоящей работе этот подход в сочетании с анализом аминокислотных последовательностей фермента у разных видов организмов был применен для оценки сходства структуры и степени корректности синтеза, осуществляемого Pol i у представителей различных классов позвоночных.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Тестирование некорректной активности Pol i проводилось в грубых экстрактах органов и тканей у половозрелых
особей позвоночных животных, принадлежащих к разным полам и разным таксономическим группам:
вьюна речного (Misgurnus fossilis, класс костных рыб, отряд карпообразных); животные были любезно предоставлены сотрудниками кафедры эмбриологии МГУ им. М.В. Ломоносова;
тритона гребенчатого (Triturus cristatus, класс земноводных, отряд хвостатых); взрослая самка была приобретена в зоомагазине (г. Москва);
травяной лягушки (Rana temporaria, класс земноводных, отряд бесхвостых); особи были приобретены в зоомагазине (г. Москва);
черепахи среднеазиатской (Ägrionemys hors-fieldii, класс пресмыкающихся, отряд черепах); взрослая самка была приобретена в зоомагазине (г. Москва);
зеленого кустарникового ужа (Philothamnus punctatus, класс пресмыкающихся, отряд змей); органы взрослого самца для проведения исследования были любезно предоставлены сотрудниками кафедры эмбриологии МГУ им М.В. Ломоносова;
домашнего петуха (Gallus domesticus, класс птиц, отряд куриных); взрослый самец был приобретен в зоомагазине (г. Москва);
обыкновенного перепела (Coturnix coturnix, класс птиц, отряд куриных); взрослые самцы были любезно предоставлены сотрудниками Института медико-биологических проблем РАН;
серой крысы (Rattus norvegicus, класс млекопитающих, отряд грызунов); самец предоставлен виварием Института молекулярной генетики РАН;
домашнего кролика (Oryctolagus cuniculus, класс млекопитающих, отряд зайцеобразных); предоставлен виварием Института молекулярной генетики РАН;
домашней собаки (Canis familiaris, класс млекопитающих, семейство волчьих); органы взрослого самца породы мастиф после процедуры кастрации были любезно предоставлены сотрудниками ветеринарной клиники «МикроПлюс» (г. Москва).
Определение активности Pol i в клеточных экстрактах. Приготовление экстрактов клеток из различных органов и тканей, а также проведение ДНК-полимеразной реакции осуществлялись, как описано нами ранее [16, 17]. Полуколичественная оценка активности Pol i рассчитывалась двумя способами: по проценту включения dGTP в 18-м положении напротив тимина матрицы олигонуклеотидного субстрата (G • 100% / (G + A)) и по проценту включенного в 18-е положение dGTP среди всех включенных в реакции нуклеотидов (G х 100% / (4A + 3B +
2C + D), где A, B, C, D — количество продуктов реакции, в которых синтез прошел с образованием 21, 20, 19, 18-членных продуктов соответственно). Расчеты проводились с помощью программы ImageQuant 5.2.
Анализ аминокислотных замен в активном центре Pol i у эукариот и построение филогенетического дерева. При сравнительном анализе использовались известные нуклеотидные последовательности гена/мРНК и аминокислотные последовательности Pol i животных и разных филогенетических таксонов: D. melanogaster (NM_169207.1 и NM_141515.2), D. rerio (BC092781.1), X. tropicalis (M_001032308.1, BC121199, NM_001032308, DQ102380), M. mus-culus (AH013032 - линия 129/J, AY515316.1 - линия A/J, AF151691.1 - линия BALB/c, BC057575.1 -линия C57/BL6, AK154537.1 - линия NOD), R. norvegicus (Xm_225844.3), P. troglodytes (XM_512140 и XM_512141), B. taurus (NM_001024692.1), H. sapiens (NM_007195.1). Для их поиска была использована программа BLAST [18].
Последовательности Pol i были выровнены с использованием CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program. Участки фрагментов, которые не могут быть достоверно выровнены, были исключены из анализа. Филогенетический анализ первичных последовательностей мРНК проводился с использованием пакета программ для филогенетического анализа нуклеотидных и полипептидных последовательностей MEGA 3.1. Филогенетическое дерево было построено методом «neighbor joining». Филогенетическая дистанция (p-distance) рассчитывалась как среднее число нуклеотидных замен, приходящихся на пару гомологичных сайтов сравниваемых нук-леотидных последовательностей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее при исследовании ферментативной активности Pol i в организме млекопитающих были исп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.