БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2009, том 26, № 1, с. 41-49
УДК 577.23.013
F0F1-ATP-CHHTA3A СТРЕПТОМИЦЕТОВ: МОДУЛИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ОЛИГОМИЦИНУ СЕРИН-ТРЕОНИНОВЫМИ ПРОТЕИНКИНА3АМИ
© 2009 г. М. Г. Алексеева1'3, С. М. Елизаров2, О. Б. Беккер13, И. К. Любимова1'3,
В. Н. Даниленко1
1Институт общей генетики им. НИ. Вавилова РАН, 119991, Москва, электронная почта: valerid@rutenia.ru
2Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, 119071, Москва
3 Научно-исследовательский центр биотехнологии антибиотиков и других биологически активных веществ
"БИОАН", 109004, Москва
Поступила в редакцию 30.07.2008 г.
Получены препараты обращенных мембранных везикул грамположительных актинобактерий Streptomyces fradiae, S. lividans и S. avermitilis и биохимически охарактеризована содержащаяся в них мембраносвязанная Р0Р1-ДТР-синтаза. Показано, что ATP-азная активность связанного с мембранами комплекса F0F1 зависит от ионов Mg2+ и умеренно стимулируется ионами Ca2+ (10-20 мМ). ATP-азная активность ингибируется К,№-дициклогексилкарбодиимидом и олигомицином A - классическими ингибиторами F^-ATP-аз, реагирующими с погруженной в мембрану F0-частью молекулы. Во всех случаях показано присутствие в препаратах как высокочувствительной, так и нечувствительной к олигомицину A популяции ATP-аз. С использованием мечения in vitro и ингибитор-ного анализа показано, что везикулы S. fradiae содержат активные мембраносвязанные серин-треониновые протеинкиназы, фосфорилирующие белки F^-комплекса. Подавление фосфорили-рования сопровождается понижением ATP-азной активности и увеличением ее чувствительности к олигомицину. Aнализ in vivo подтверждает увеличение чувствительности к олигомицину при подавлении эндогенного фосфорилирования в клетках актинобактерий. Секвенирование генов S. fradiae, кодирующих связывающие олигомицин A- и С-субъединицы, выявило их близкое филогенетическое родство генам S. lividans и S. avermitilis.
Мембраносвязанная F^-ATP-синтаза (EC 3.6.1.34) представляет собой многосубъединичный фермент, состоящий из растворимой F1-части, катализирующей синтез ATP из ADP и неорганического фосфата за счет ротационного движения центрального стержня молекулы, связанного с F1 и с погруженной в мембрану F0-частью молекулы [1, 2]. F0 формирует протонный канал, дающий энергию для синтеза ATP за счет транслокации генерированных окислительным фосфорилированием протонов по градиенту их концентрации [1, 2]. Синтезированная ATP далее используется в клетке как универсальный источник энергии. ATP-син-таза может также переносить протоны в противоположном направлении за счет гидролиза ATP. Это сопровождается вращением F1-части молекулы в направлении, противоположном направлению при синтезе ATP [1, 2]. Обычно активность ATP-синтазы определяют, измеряя скорость обратной реакции.
Сокращения: CTnK - серин-треониновые протеинкиназы,
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид, TXY - трихлорук-
сусная кислота.
FoFj-ATP-синтаза и ее гомологи обнаружены на внутренней мембране митохондрий, мембране ти-лакоидов хлоропластов и цитоплазматической мембране бактерий. При этом растворимая Fj-часгь молекулы синтазы погружена в кортекс митохондрий и тилакоидов или экспонирована в цитоплазму бактерий. Недавно обнаружено, что в клетках эукари-от присутствует также фракция молекул F0F1-ATP-синтазы, локализованных во внешней мембране, с F1-частью, экспонированной во внеклеточную среду. Считают, что эта популяция F^-ATP-синтазы вовлечена в поддержание клеточного pH, а также в регуляцию эндоцитоза, пролиферации и апопто-за [3]. В свете новых функций экспонированной на клеточной поверхности F^-ATP-синтазы ее рассматривают как перспективную биомишень для разработки специфических терапевтических агентов [4].
F^-ATP-синтазы были выделены из грамот-рицательных и грамположительных бактерий, включая актинобактерии родов Steptomyces, Mycobacterium и Corynebacterium [5-8]. Благодаря высококонсервативной структуре, ATP-синтазный ком-
плекс из разнообразных источников, включая филогенетически удаленные группы микроорганизмов, детально охарактеризован, и этот комплекс хорошо подходит для проведения сравнительных исследований. При большом сходстве структуры FoFj-ATP-синтазы актинобактерий отличает от фермента из других эубактерий зависимость от ионов Ca2+ [8, 9] и чувствительность к макролидно-му антибиотику олигомицину [9]. Опубликованы единичные указания на возможное участие проте-инкиназных сигнальных систем клетки в регуляции работы F^-ATP-синтаз [10]. Ранее мы показали, что во фракции мембран актинобактерии Strepto-myces fradiae содержатся по крайней мере две активные серин-треониновые протеинкиназы (СТПК), способные фосфорилировать белки мембран, и их активность регулируется ионами Са2+ [11, 12].
Целью данной работы является биохимическая характеристика F^-ATP-синтазы (ATP-азы) в препаратах обращенных мембранных везикул (протеолипосом) стрептомицетов и анализ возможного участия СТПК в фосфорилировании и регуляции активности F^-ATP-синтазы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы, векторы, среды и условия культивирования. В работе использовали штаммы Streptomyces: S. fradiae АТСС19609; S. lividans 66 (ВКПМ, г. Москва), S. avermitilis АТСС31272 и штаммы Escherichia coli: DH5a
("Promega"); BL21(DE3) ("Novagen"); плазмиды pET22b и pET32a ("Novagen").
Штамм S. fradiae выращивали в жидкой среде YEME с 25% сахарозы [13]. Для определения чувствительности штамма S. lividans 66 к антибиотикам использовали агаризованную среду YSP. Для тестирования на чашках Петри использовали агаризованную среду МГ следующего состава: 0.5% мальтэкстракта ("Sigma"), 0.4% дрожжевого экстракта ("Difco"), 0.05% NaCl, 0.05% MgSO4, 0.05% K2HPO4, 0.0001% FeSO4, 0.1% KNO3, 2% глюкозы, рН 7.5. Клетки E. coli выращивали на среде Лурия. Твердые среды содержали 2.0% агара. Для обеспечения селективного роста плазмидосодержащих клеток добавляли ампициллин (100 мкг/мл).
Манипуляции с ДНК. Суммарную ДНК выделяли из клеток S. fradiae согласно [14, 15]. Выделение плазмидной ДНК, приготовление компетентной культуры E. coli, трансформацию и анализ ре-комбинантных плазмид проводили с использованием стандартных методов [15, 16].
Амплификацию (ПЦР) с ДНК S. fradiae проводили с использованием набора "Амплификация" ("Dialat Ltd") на приборе PTC-0150 ("MJ Research, Inc."). На первом этапе работы были сконструированы шесть олигонуклеотидов, гомологичных фланкирующим областям субъединиц А, В и С и содержащих сайты BamHI и HindIII для клонирования в экспрессионном векторе pET22b:
ATPAN (5'CCGCGGATCCCCATGCGCCACGCTGAAGG3'), ATPAC (5'ATTCAAGCTTTGCTCAGTGGTGCTCGGC3'), ATPBN (5'ATCCGGATCCGGCGGCCGGCCTGATCCGC3'), ATPBC (5'CCGCAAGCTTGGCCAGCTCGTCGGCGAGC3'), ATPCN (5'ATTCGGATCCCGGTGGCCAACCCCCAC3'), ATPCC (5'CCGCAAGCTTAGGCCGATGACGAGCTCGGGGA3').
Скрининг рекомбинантных клонов проводили с помощью ПЦР с использованием стандартных прай-меров T7prom (5'TTAATACGACTCACTATAGG3') и T7term (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3').
Нуклеотидные последовательности ДНК
определяли по методу Сэнгера. Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием программы BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Для сравнения трех и более аминокислотных последовательностей использовали программу CLUSTALW (www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html).
Денатурирующий электрофорез в полиакри-ламидном геле (SDS-PAGE) белков проводили по методу Лэммли [17].
Чувствительность стрептомицетов к олигомицину А определяли, измеряя диаметр зоны подавления роста клеток Streptomyces, рассеянных газоном на агаризованной среде, вокруг бумажных дисков, пропитанных олигомицином или олиго-мицином с ингибитором СТПК. Споровую суспензию, полученную путем смыва с агаризованной полноценной среды и пропущенную через ватный фильтр, смешивали с агаризованной средой МГ (0.7% агара) при рН 7.5 и засевали (1 х 107 спор на чашку) чашки Петри с агаризованной средой МГ (2% агара). После застывания агара на чашки накладывали бумажные диски, содержащие антибиотик и ингибитор СТПК. Газон выращивали в течение 24 ч при +28°С.
Для получения протеолипосом штаммы S. /га-diae, S. lividans и S. avermitilis выращивали в основ-
F0F1-ATP-CHHTA3A CTPEnTOMHU,ETOB
43
ной жидкой питательной среде, приготовленной, как описано ранее [11, 12], до поздней экспоненциальной фазы роста, собирали мицелий центрифугированием, суспендировали в буфере (50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ MgCl2, 10% глицерин, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), 0.5 мМ дитиотреитол), содержащем 1 мг/мл лизоцима и 1 мкг/мл ДНК-азы, и получали протопласты, инкубируя в течение 30 мин при 37°С. Протопласты разрушали озвучиванием в отечественном ультразвуковом дезинтеграторе У3ДН-1, У-42 в течение 3 мин при частоте 30 кГц, после чего удаляли клеточный дебрис центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин. Мембраны осаждали центрифугированием при 180000 g в течение 120 мин, промывали указанным буфером и хранили в жидком азоте.
Фосфорилирование белков протеолипосом
проводили в течение 10 мин при 28°С в буфере следующего состава: 10 мМ триэтаноламин, 0.1 М NaCl, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.15 М Р-глицеро-фосфат, 0.1 М NaF, 0.5 мМ ФМСФ, 10% глицерин, по 1 мкг/мл леупептина и пепстатина, pH 7.8, содержащем 0.5 мМ [y-32P]ATP (5000 имп/мин на пмоль; "Фосфор", PФ) в присутствии 100 мкг/мл белка протеолипосом.
АТР-азную активность в протеолипосомах Streptomyces анализировали по высвобождению 32P; после отделения его от [y-32P]ATP, связанной с активированным углем марки Norit A [18]. Pеакци-онная смесь для определения ATP-азной активности (0.10 мл) содержала 100 мкг/мл белка везикул, 50 мМ трис-HCl, pH 7.5, 20 мМ MgCl2 (или 10 мМ CaCl2), 50 мМ NaCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.1 мМ ФМСФ, 10% глицерин, 2 мМ [y-32P]ATP (50 имп/мин на пмоль). При анализе ингибиторов последние добавляли в реакционную смесь за 10 мин до введения меченой ATP и выдерживали смесь в течение 10 мин при комнатной температуре. Pеак-цию начинали, добавляя меченую ATP. Через 15 мин инкубации при 37°C реакцию останавливали, добавляя 1 мл 5% трихлоруксусной кисл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.