БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 1, с. 90 - 96
УДК 577.152.52
ФАКТОР ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ МОЗГА БЫКА
© 2006 г. О.А. Черепкова, Е.М. Лютова, Б.Я. Гурвиц*
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33; факс: (495)954-2735, электронная почта: bella@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 01.09.04 После доработки 22.12.04
В статье приведены методы очистки и частичная характеристика фактора ингибирования миграции макрофагов (Macrophage migration inhibitory factor, MIF) из цитозоля мозга быка. Разработан быстрый и сравнительно простой способ выделения, основанный главным образом на эксклюзионной хроматографии на полимере TSK Toyopearl, сорбционные свойства которого позволяют выделять MIF с запаздыванием по отношению к элюированию других белков с аналогичной молекулярной массой. Показано, что с помощью данного метода можно получать MIF с высоким выходом (0,1 мг гомогенного белка на 1 г сырой ткани). Идентичность выделенного белка MIF подтверждена с помощью электрофореза в присутствии Ds-Na, иммуно-блоттинга, секвенирования N-концевой последовательности аминокислотных остатков, а также на основании определения присущей MIF кето-енолтаутомеразной активности с использованием _р-гидроксифенил-пирувата в качестве субстрата.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фактор ингибирования миграции макрофагов, гель-фильтрация, кето-енолтаутоме-раза.
Фактор ингибирования миграции макрофагов (Macrophage migration inhibitory factor, MIF) известен как один из первых цитокинов, обнаруженных около 40 лет назад. MIF был идентифицирован как фактор, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, по его способности тормозить миграцию макрофагов in vitro [1, 2]. Однако начало широким биохимическим исследованиям MIF было положено лишь 25 лет спустя, после создания рекомбинантного белка MIF человека и моноклональных анти-MIF антител [3]. В последующие годы MIF был вновь «открыт» как гормон передней доли гипофиза [4] и медиатор системного ответа организма на стресс [5, 6]. Участие MIF на всех уровнях функционирования стресс-индуцируемой гипотала-мо-гипофизарно-адреналовой системы, регуляция экспрессии MIF в гипофизе под действием гипоталамического кортиколиберина и его высвобождение из гипофиза совместно с адрено-кортикотропным гормоном [5, 7, 8] могут служить подтверждением нейроэндокринной роли MIF.
Принятые сокращения: МШ — фактор ингибирования миграции макрофагов, ЖХВД — жидкостная хроматография высокого давления, ТФК — трифторуксусная кислота, Р-МБ — Р-меркаптоэтанол.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
Было показано, что низкомолекулярный высококонсервативный белок MIF (12,5 кДа) широко распространен в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих). Его наибольшее количество обнаружено в макрофагах и в различных отделах мозга. Исследования иммунологической роли MIF in vivo и in vitro позволили охарактеризовать его как цитокин, вызывающий усиление воспалительных реакций и торможение противовоспалительного и иммуносупрессорного действий глюкокортикоидов, главным образом дексаме-тазона и гидрокортизона в пикомолярных концентрациях [9, 10]. Обнаружено, что под действием глюкокортикоидов индуцируется высвобождение из клеток MIF. Этот процесс сопровождается усилением экспрессии таких цитокинов, как интерлейкины (IL-1P, IL-2, IL-6, IL-8), фактор некроза опухоли-a, интерферон-у [10, 11]. При дальнейшем увеличении концентрации глюкокортикоидов, в большинстве случаев в результате различных стрессорных воздействий, противодействующий эффект MIF не наблюдается и его секреция тормозится, что свидетельствует о тонкой системе регуляции организма в состоянии стресса.
В настоящее время широко исследуется роль MIF в патогенезе нейродегенеративных заболеваний [12], вирусных инфекций [13], различных
воспалительных процессов [10] и онкологических болезней [14, 15]. Показано его участие в клеточной пролиферации [16], дифференциров-ке [17], апоптозе [18]. Оказалось также, что МГР является ферментом, обладающим кето-енолта-утомеразной и протеиноксидоредуктазной активностями [19—22].
Несмотря на то что М]Е достаточно хорошо изучен, многие аспекты его активности оказались противоречивыми. В частности, наиболее интересный для биологии и медицины факт регуляции секреции М]Е под действием глюко-кортикоидов, выявленный на клетках грызунов, не подтверждается при изучении М]Е человека. Более того, оказалось, что ни экзогенные глю-кокортикоиды, ни стимуляторы секреции АКТГ не приводят к изменению концентрации М]Е в крови человека [23]. В результате всестороннего структурно-функционального анализа М1Б [24—26] не была выявлена взаимосвязь между его ферментативной и биологической активностями. Не вполне ясны биохимические механизмы участия М]Е в патогенезе многих весьма распространенных заболеваний.
Генетический анализ показал существование единственного гена М]Е человека и нескольких генов М]Е мыши [27, 28]. Важным фактом является идентификация генетического полиморфизма МЩ который коррелировал с предрасположенностью человека к некоторым аутоиммунным и воспалительным заболеваниям [8, 10]. На основе сравнительного анализа полиморфных вариантов М1Е возможно сравнение специфичных комбинаций генетических изменений у здоровых и больных людей и выявление участия М1Е в патогенезе болезни. Предполагается, что при развитии ревматического артрита и других воспалительных процессов функциональный полиморфизм, лежащий в основе высокого или низкого уровня экспрессии МЩ может способствовать усилению или торможению болезни соответственно.
Гомология аминокислотной последовательности между М]Е человека и мыши составляет 89%, однако М]Е не гомологичен ни одному из известных белков. Уникальна не только первичная, но и третичная структура МЩ которая не свойственна ни одному из известных цитокинов или гипофизарных гормонов [29]. Было показано, что М]Е в физиологических концентрациях образует олигомерную структуру, представляющую собой смесь мономеров, димеров и триме-ров [30], с преобладанием димера у М]Е человека или мономера у М]Е быка. Однако при применении различных методов исследования получены различные данные о перераспределении протомеров в олигомерной структуре М1Е
Недавно нами было обнаружено новое свойство MIF [31, 32]. На основании структурно-функциональных характеристик MIF было предположено его участие в биохимических механизмах формирования защитных реакций организма при тепловом шоке, приводящем к агрегации и денатурации лабильных белков. В тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики тепловой агрегации модельных белковых субстратов — гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и малатдегидроге-назы из сердца свиньи, — продемонстрированы шапероноподобные свойства MIF, проявляющиеся в торможении агрегации субстратов в присутствии MIF.
Можно полагать, что полифункциональность MIF в различных системах является результатом его существования в виде различных изоформ и олигомерных структур, образующихся вследствие посттрансляционных модификаций или конформационных переходов. В этой связи становится понятной необходимость дальнейшего изучения свойств и механизмов действия MIF и разработки методов его выделения из различных источников.
В данной работе представлены результаты исследования MIF, выделенного из мозга быка с применением нового оригинального метода, позволяющего получить гомогенный белок с высоким выходом. Приводится сравнительный анализ различных методов выделения MIF.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы. Использованы: ацетонитрил (HPLC grade) фирмы «Merck» (Германия); три-фторуксусная кислота (sequence grade) фирмы «Knauer» (Германия); стандарты молекулярной массы, Tris, DEAE-Servacel, мембраны иммоби-лонполивинилдифторид (PVDF), конъюгат кроличьих антител к IgG козы с пероксидазой хрена и р-гидроксифенилпируват фирмы «Sigma» (США); светочувствительная пленка (Clear blue X-Ray) фирмы «Pierce» (США); ECL-набор фирмы «Amersham Life Science» (США); акрил-амид, М,№-метиленбисакриламид и персульфат аммония фирмы «Serva» (Германия); HW-55 Toyopearl фирмы «Toyo Soda» (Япония); поли-клональные антитела (Anti-human MIF Antibody, Catalog № AB-289-PB) фирмы «R&D Systems» (Англия); все другие реактивы марки х.ч. или ч.д.а., а также вода, деионизованная с помощью аппарата Milli Q System («Millipore», США).
Получение экстракта мозга быка. Мозг, полученный на мясокомбинате, замораживали и хранили в течение длительного времени при
—70°. Перед выделением ткань размораживали и гомогенизировали в гомогенизаторе типа Waring blender в 100 мМ Tris-HCl-буфере, pH 7,8 (3 : 1), содержавшем 100 мМ KCl, 5 мМ ß-меркаптоэта-нол (ß-ME) и 1 мМ фенилметилсульфонилфто-рид (PMSF). Гомогенат центрифугировали при 10 000 g в течение 30 мин. Затем супернатант центрифугировали при 60 000 g в течение 1 ч на центрифуге L7 фирмы «Beckman» (США). Вторичный супернатант нагревали в водяной бане при 58° 20 мин с последующим центрифугированием при 60 000 g в течение 1 ч. Супернатант подвергали высаливанию сульфатом аммония до конечного насыщения 80%. Полученная суспензия содержалась в течение длительного времени при 4°.
Эксклюзионная хроматография. После центрифугирования аликвоты суспензии белка в сульфате аммония при 12 000 g в течение 20 мин осадок растворяли в 20 мМ Tris-HCl-буфере, pH 7,0, и наносили на колонку с Toyopearl HW-55 (1,6 х 70 см), уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили со скоростью 0,6 мл/мин. Фракции, содержавшие MIF, определяли по та-утомеразной активности, далее их подвергали электрофорезу в присутствии Ds-Na, иммуно-блоттингу и микросеквенированию.
N-Концевое микросеквенирование. Автоматическое микросеквенирование методом Эдмана проводили на секвенаторе модели 473 A («Applied Biosystems», Германия), снабженном системой on-line анализа производных фенил-тиогидантоина. После электрофореза и элект-роблоттинга на PVDF-мембраны MIF-содержа-щие полосы вырезали и направляли на микро-секвенирование белка непосредственно с мембраны по стандартной методике.
Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.