ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 1, с. 5-16
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 576.32.36
ФАКТОРЫ КОМПЕТЕНЦИИ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ДЛЯ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ В НЕЙРОНАЛЬНОМ НАПРАВЛЕНИИ ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ СЕТЧАТКИ У ТРИТОНА
© 2015 г. Э. Н. Григорян
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 E-mail: e.grigoryan@hotmail.com Поступила в редакцию 07.04.2014 г.
Проанализированы клетки ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого тритона, обладающие уникальной способностью к репрограммированию в клетки сетчатки in vivo. Суммированы собственные и имеющиеся в литературе данные об особенностях биологии этих клеток — от морфологии до молекулярного профиля, которые могут быть ассоциированы со способностью к изменению фенотипа. Установлено, что в РПЭ взрослого тритона сочетаются молекулярные признаки специализированных и малодифференцированных клеток. Отмечено, что персистентная на низком уровне пролиферация и быстрая смена специфических белков цитоскелета могут также способствовать успеху репрограммирования клеток РПЭ в нейрональном направлении. Каждый из рассмотренных факторов компетенции к репрограммированию может быть обнаружен для РПЭ животных, чьи клетки не способны in vivo к смене фенотипа на нейральный, но их совокупность, подкрепленная пермиссивным для конверсии эпигенетическим состоянием, возможно, является внутренним свойством только РПЭ тритона.
DOI: 10.7868/S000233291501004X
В настоящее время репрограммирование клеток — одна из многообещающих перспектив реге-нерационной медицины (Kiskinis, Eggan, 2010; Svendsen, 2013; Kelaini etal., 2014), и восстановления тканей глаза в частности (Enzmann et al., 2003; Bharti et al, 2011; Phillips et al, 2012). В многочисленных исследованиях индукции и результатов клеточного репрограммирования чаще используются соматические клетки взрослых животных и человека, в первую очередь фибробласты в условиях in vitro. Значительно меньше внимания уделено зрелым тканям, способным в условиях in vivo, после травмы, к "естественной" конверсии в другой тип дифференцировки. Такой тканью является ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) взрослого тритона (Urodela), превращающийся в процессе тканевой регенерации в нейроны и гли-альные клетки сетчатки, в результате чего образуется новая, функционирующая сетчатка (Stone, 1950; Mitashov, 1997; Chiba, Mitashov, 2007; Grigo-ryan, 2012).
В процессе конверсии дифференцированные клетки РПЭ претерпевают ряд морфологических, биохимических и молекулярных изменений и образуют транзитную, состоящую из нейроэпители-альных клеток популяцию, которая впоследствии и формирует новую сетчатку (Mitashov, 1997; Ми-ташов, 2007; Chiba, Mitashov, 2007). Ценность такой модели трудно преувеличить, так как она дает
возможность вести поиск особых, позволяющих репрограммирование, свойств нативной ткани in situ, а также изучать факторы, индуцирующие и регулирующие процесс конверсии.
В обзоре объединены полученные в разное время данные о клеточной и молекулярной биологии нативного РПЭ тритона в попытке выявить особенности, ассоциированные с их уникальным свойством — превращением в нейроны и глиаль-ные клетки новой функционирующей сетчатки. В данной статье не предполагается рассмотрение механизмов индукции и регуляции репрограмми-рования РПЭ тритона, являющихся наиважнейшей составляющей процесса конверсии, поскольку они частично уже изложены в других обзорах (Миташов, 2007; Chiba, Mitashov, 2007; Grigoryan, 2012).
ПРОЛИФЕРАЦИЯ В НАТИВНОЙ ТКАНИ РПЭ КАК ПРЕРЕКВИЗИТ
На полных сериях срезов нормальных глаз тритонов разных видов (Triturus vulgaris, T. crista-tus, Pleurodeles waltl) с использованием радиоавтографических и иммунохимических методов нами были проведены специальные исследования для определения пролиферативной активности клеток РПЭ. В результате в нативном РПЭ тритонов были обнаружены клетки в пролиферативой фа-
зе. Так, с помощью импульсного мечения 3Н-ти-мидином у половозрелых тритонов T. vulgaris было выявлено до 3% синтезирующих ДНК клеток и единичные клетки в митозе (Григорян, Миташов, 1979). Позже с использованием другого вида тритонов (P. waltl) и оригинального способа длительной доставки аналога тимидина — BrdU, а также при многократном введении предшественника синтеза ДНК 3Н-тимидина данные о наличии в РПЭ клеток в фазе синтеза ДНК были подтверждены (Новикова и др., 2008). Во всех случаях пролиферация клеток нативного РПЭ характеризовалась длинным S- периодом и редкими митозами. О наличии в нативном РПЭ тритона клеток в состоянии пролиферации свидетельствуют и результаты, полученные при использовании антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток PCNA (Ю.В. Маркитантова, неопубликованные данные).
Наряду с этим в литературе имеются данные, свидетельствующие о присутствии пролифериру-ющих клеток в РПЭ птиц и млекопитающих. Такие клетки были выявлены, например, в краевой зоне РПЭ цыпленка вскоре после вылупления (Fisher, Reh, 2000). При использовании маркеров клеточной пролиферации и специфической диф-ференцировки удалось выяснить, что клетки зрелого РПЭ взрослых крыс также способны входить в пролиферативную фазу. В основном они локализовались в периферической области слоя, а их число было в 10 раз выше у крыс альбиносов по сравнению с пигментированным диким типом (Al-Hussaini et al., 2008). В наших экспериментах при культивировании РПЭ in vitro в составе задней стенки глаза, полученной от взрослых крыс альбиносов, маркированные BrdU клетки также встречались на периферии, однако с невысокой частотой (Новикова и др., 2010).
Если клетки РПЭ взрослого тритона и развивающегося цыпленка способны регенерировать сетчатку после удаления in situ, то клетки РПЭ крысы этой способностью не обладают. Поэтому нельзя утверждать, что возможность редкого входа клеток в пролиферацию сама по себе является основой способности к репрограммированию этих клеток в новом направлении дифференци-ровки. И различия числа клеток, входящих в фазу синтеза ДНК, и даже частота делений еще не определяют успех репрограммирования. У высших позвоночных эта способность позволяет осуществлять только ограниченную регенерацию собственно слоя РПЭ (Korte et al., 1994). Эта возможность была также продемонстрирована недавно при незначительном разрушении РПЭ йо-датом натрия или лазером (Von Leithner et al., 2010; Machalinska et al., 2013).
В то же время у амфибий свойство выйти из стадии покоя и перейти к делениям клетки РПЭ
используют в начале репрограммирования. Затем, вступая на путь пролиферации, клетки постепенно теряют свой основной специфический признак — меланиновые гранулы, которые «разбавляются» при делении на фоне прекращения синтеза меланина (Григорян, Миташов, 1979; Григорян, 1998). В ходе репрограммирования РПЭ в сетчатку были выявлены уменьшение времени клеточного цикла и изменения его параметров — сокращение G1 и увеличение S-фазы (Stro-eva, Mitashov, 1983). Было выяснено также, что для проявления первых черт специализации в промежуточной популяции возникающих из РПЭ нейробластов у тритона необходимо 6—7 делений клеток (Миташов, 1980).
Таким образом, низкоуровневая пролифера-тивная активность в РПЭ — внутренняя способность этой ткани, общая для всех взрослых позвоночных животных. Однако только у амфибий после разобщения с сетчаткой пролиферация приводит к возникновению быстро амплифици-рующейся клеточной популяции, развивающейся в нейральном направлении. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что попытки только увеличения пролиферативной активности РПЭ in situ у высших позвоночных вряд ли приведут к репро-граммированию клеток в нейральном направлении. Косвенно это подтверждается уже упоминавшимися данными, полученными на РПЭ крыс альбиносов, имеющих депигментирован-ный РПЭ и повышенную (относительно серых крыс) пролиферацию в слое, но не способных при этом к смене фенотипа РПЭ в нейральном направлении in vivo.
Механизм активации входа в S-фазу пролиферации клеток РПЭ тритона. Недавно были сделаны попытки выявления молекулярного механизма входа клеток РПЭ тритона в S-фазу клеточного цикла, вызванного разобщением с сетчаткой (Mi-zuno et al., 2012; Yoshikawa et al., 2012). В первой работе активацию MEK— ERK-каскада изучали in vivo после удаления сетчатки (Mizuno et al., 2012). В этой системе было выявлено неотложное начало работы этого сигнального пути уже через 30 мин после операции. В другой работе (Yoshikawa et al., 2012) изменения в сигнальной активности MEK—ERK были изучены в РПЭ тритона после изоляции сетчатки и кратковременного культивирования ткани в составе задней стенки глаза in vitro. В результате были отмечены три важные составляющие этого события: сигнальный путь MEK—ERK, гепаринзависимые сигнальные пути и освобождение клеток РПЭ от контактного инги-бирования. Активация сигнального пути MEK— ERK происходила в течение 1 ч после операции. По мнению авторов (Mizuno et al., 2012; Yoshikawa et al., 2012), это происходит за счет "ир"-регуля-ции экспрессии каждого из компонентов пути по механизму положительной обратной связи. От-
метим, что in vivo вход в клеточный цикл происходит у разных видов тритонов и при разных операциях в разное время, но в течение первых 10 сут после разобщения с сетчаткой (Григорян, 1998). Что происходит в еще морфологически нативном слое РПЭ в этот период, только предстоит узнать. Тем не менее полученные данные свидетельствуют о том, что РПЭ тритона обладает механизмом быстрого запуска сигнального каскада для входа в пролиферацию, и тем самым в процесс репро-граммирования.
При рассмотрении вопроса о пререквизитах ре-программирования имеет смысл обратиться и к факторам стабилизации дифференцировки клеток РПЭ, так как именно они могут запрещать или разрешать клеткам вступать на путь конверсии.
УСЛОВИЯ СТАБИЛИЗАЦИИ
ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РПЭ ТРИТОНА
Меланогенез. Учитывая способность РПЭ взрослого тритона к фенотипической трансформации in situ, можно предположить, что у этих животных система стабилизации дифференци-ровки не столь "жесткая" по сравнению с РПЭ взрослых млекопитающих. На морфол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.