БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 201 - 207
УДК 57.212.3
ФАЛЬШИВАЯ НОТА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ЙОТА В АНСАМБЛЕ СТОРОЖЕЙ ГЕНОМА МЛЕКОПИТАЮЩИХ*
© 2006 г. Л.В. Генинг1, А.В. Макарова1, А.М. Малашенко2, В.З. Тарантул1**
1 Институт молекулярной генетики PAH, 123182 Москва, пл. Курчатова, 2; факс: (495)196-0221,
электронная почта: tarantul@img.ras.ru
2 Научно-исследовательская лаборатория экспериментально-биологических моделей РАМН,
143440 Московская область, пос. Светлые Горы
Поступила в редакцию 22.07.05 После доработки 06.09.05
ДНК-полимераза йота (Poli) млекопитающих является одним из членов Y семейства ДНК-полимераз. Эти ферменты в числе многих других ферментов-«сторожей генома» отвечают за поддержание его стабильности. Они участвуют в преодолении определенных типов повреждений ДНК и характеризуются низкой точностью включения оснований в ДНК. Уникальное свойство Poli включать преимущественно G напротив Т матрицы позволило нам идентифицировать продукт этого фермента среди продуктов синтеза всех остальных ДНК-полимераз. Такой продукт можно назвать «фальшивой нотой» ДНК-полимеразы йота. Мы определяли ферментативную активность Poli в грубых экстрактах клеток различных органов инбредных линий мышей C3H/Sn, 101/H, C57BL/6, BALB/c 129/J, отличающихся по ряду параметров. Относительно высокая интенсивность «звучания» фальшивой ноты Poli была обнаружена только в экстрактах клеток семенников и головного мозга у мышей линий (C3H/Sn, 101/H, C57BL/6 и BALB/С ). У мышей линии 129/J, содержащих нонсенс-мутацию во втором экзоне гена poli, ферментативная активность Poli была достоверно обнаружена только в экстрактах клеток головного мозга. Полученные данные показывают, что даже при наличии нонсенс-мутации в гене poli активный фермент может образовываться в отдельных типах клеток. Это подтверждает вывод о тканеспецифичной регуляции экспрессии гена poli, которая осуществляется за счет альтернативного сплайсинга. Полуколичественная оценка активности Poli в разных линиях мышей, отличающихся по радиочувствительности, свидетельствует о наличии обратной зависимости между ферментативной активностью Poli в семенниках и их устойчивостью к радиационному облучению.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДНК-полимераза йота, сторожа генома, линии мышей, головной мозг, семенники, радиоустойчивость.
Ключевая роль в поддержании стабильности генома принадлежит репликативным ДНК-по-лимеразам, синтезирующим ДНК с высокой точностью (error-free ДНК-полимеразы). Однако активные центры этих ферментов плохо приспособлены для синтеза ДНК на поврежденных участках матрицы, что вызывает остановку репликации и, как следствие, гибель клетки. На выручку в этих случаях приходят ДНК-полиме-разы, называемые иногда сторожами генома. Существует около полутора десятков таких ферментов, составляющих вместе целый «ансамбль», каждый из участников которого по отдельности или в разном сочетании с другими
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Рареге in Press, BM 05-172, 20.11.2005.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
обеспечивают преодоление тех или иных многочисленных типов повреждений ДНК в клетке. К таким, в частности, относятся ДНК-полимера-зы Y-семейства (Poln, Poll, PolK и Revl) [1]. Но эти ДНК-полимеразы допускают много ошибок при использовании в качестве матрицы неповрежденной ДНК. Из-за склонности к некорректному синтезу ДНК эти ферменты называют error-prone ДНК-полимеразами [1—3].
Считается, что самой низкой точностью синтеза ДНК, которая зависит от особого строения каталитического центра и способности использовать не-Уотсон-Криковское взаимодействие, обладает Poll. Отличительным свойством этого фермента является ярко выраженная зависимость корректности осуществляемого им синтеза от нуклеотидного состава матрицы. Так, наиболее корректно Poll копирует матрицы, содержащие пурины. Выступая в качестве защит-
ника генома, Poli способна не только относительно корректно копировать гуанины матрицы, но и встраивать напротив гуанинов, модифицированных различными химическими группами, правильное основание — цитидин [4—6]. Этого, как правило, достаточно для продолжения синтеза в поврежденном участке ДНК, далее к этому синтезу уже могут подключаться более процессивные и способные вести более корректный синтез ДНК-полимеразы, например Pol к [7]. Если при копировании цитидинов Poli соблюдает правило Уотсона—Крика, то копирование тимидинов происходит с явным нарушением этого правила. Только для Poli, млекопитающих описана необычная способность встраивать гуанин напротив тимидина матрицы, даже если в реакционной смеси присутствует дезоксиаденозин трифосфат [8] .Такое уникальное свойство Poli позволяет идентифицировать продукт этого фермента среди продуктов синтеза всех остальных ДНК-полимераз. Мы назвали такой продукт фальшивой нотой Poli.
Хотя биохимические свойства очищенной Pol i изучены довольно детально, роль этого фермента in vivo остается неясной. Исследования, проведенные in vitro, показывают, что Poli, с одной стороны, может способствовать сохранению структуры генома, а с другой — целенаправленно изменять ее. Однако пока не существует данных, позволяющих однозначно разрешить, какая из активностей фермента и для какой цели используется in vivo. Более того, имеющиеся данные весьма противоречивы. Так, первоначально на культуре клеток лимфомы Бер-кетта с делецией обеих аллелей гена poli было показано, что Poli принимает участие в гипермутагенезе вариабельных участков генов иммуноглобулинов [9]. Но более поздние исследования, проведенные на мышах линии 129, мутант-ных по гену poli [10], а также на мышах, одновременно содержащих мутации в генах, кодирующих Poli и Pol к [11], показали, что данные мутации не влияют на гипермутагенез вариабельных участков этих генов. Похожее противоречие содержится в работах, посвященных выяснению роли Poli в развитии аденомы легких, индуцируемой уретаном [12, 13]. В более ранней работе этой серии [12] авторы утверждали, что причина развития опухолей кроется в мутагенном действии Poli, тогда как последняя работа [13] показывает, что появление опухолей связано с дефицитом этого фермента, обусловленным мутацией в кодирующем его гене.
Поскольку информация об уровне активности Poli in vivo может оказаться полезной для выяснения его роли в организме, некоторые наши исследования последних лет были направлены
на тестирование активности Poli в клеточных экстрактах различных органов и тканей мышей. Так, нам удалось показать, что активность, подобная активности Poli, наиболее ярко выражена в экстрактах клеток семенников и головного мозга мышей линии C57BL/6 [14]. Выяснилось также, что имеет место корреляция между уровнем ферментативной активности Poli в мозгу мышей и агрессивностью поведения животных [15].
В настоящей работе ферментативная активность Poli анализировалась в нескольких линиях мышей, отличающихся по ряду параметров, в частности, по наличию мутаций в гене poli и по чувствительности семенников к радиационному облучению.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Линии мышей. В экспериментах по определению активности ДНК-полимераз в экстрактах клеток из различных органов использовали 5 инбред-ных линий мышей: C3H/Sn, 101/H, C57BL/6, BALB/c и 129/J из коллекционного фонда Научно-исследовательской лаборатории экспериментально-биологических моделей РАМН (Y).
Определение активности ДНК-полимераз в клеточных экстрактах. Экстракты из различных тканей мышей получали, как описано нами ранее [14].
В качестве субстрата для определения активности ДНК-полимераз использовали два комплементарных олигодезоксирибонуклеотида (17 и 30 нуклеотидов) [8], которые при гибридизации образуют дуплекс с выступающим 5'-концом:
5'-GGAAGAAGAAGTATGTT-3'
3'-CCTTCTTCTTCATACAATCTTACTTCTTCC-5'.
Мечение 32P короткого 17-членного олиго-нуклеотида с 5'-конца осуществляли как описано нами [14]. Реакционная смесь, использовавшаяся в экспериментах для изучения ДНК-син-тезирующего потенциала экстрактов клеток различных органов мыши, помимо олигонуклео-тидного субстрата содержала два дезоксинук-леотидтрифосфата: dATP и dGTP. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 300 нМ субстрата в 50 мМ буфере Tris-HCl, pH 8,0, содержавшем 5 мМ MgCl2 и 1 мМ дитиотриэтола (DTT), 5 мкл экстракта соответствующей ткани и 1 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, при 37°. Время инкубации во всех случаях, кроме тех, когда использовались экстракты клеток семенников, составляло 15 мин. При использовании экстрактов клеток семенников это время было
сокращено до 4 мин. Реакцию останавливали охлаждением во льду с последующим добавлением равного объема смеси 95%-ного формами-да, 50 мМ ЭДТА, и 0,05% бромфенолового синего. Электрофорез продуктов реакции осуществляли в 20%-ном ПААГ в присутствии 7 М мочевины в Tris-боратном буфере. После электрофореза гель заворачивали в полипропиленовую пленку и радиоавтографировали с помощью экрана Storage Phosphor Screen («Molecular Dynamics», США). Автограф сканировали на фосфоримиджере Storm 840 («Amersham Biosciences», Англия). Данные анализировали с помощью программы Image Quant 5,2.
ПЦР-генотипирование 27-го кодона гена poll. Эту процедуру, с точным воспроизведением описанной методики [10], проводили для выявления мутации во втором экзоне гена poll. С этой целью из лизатов клеток головного мозга исследованных мышей амплифицировали фрагмент ДНК длиной 88 п.н. и обрабатывали его рестриктазой TaqI.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На использованном в качестве субстрата олигонуклеотидном дуплексе с выступающим 5'-концом в присутствии dATP и dGTP любая известная ДНК-полимераза, кроме Poli, на 3'-конце затравки будет синтезировать тетранукле-отид AGAA. Поскольку известно, что ДНК-по-лимераза йота напротив T преимущественно встраивает G, являясь при этом дистрибутивным ферментом, то в ее присутствии в основном будет образовываться 18-членный олигонуклео-тид, состоящий из затравки и присоединенного к ее 3'-концу дезоксигуанидинмонофосфата.
Короткие фрагменты ДНК одинаковой длины, но разного нуклеотидного состава часто обладают разной эле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.