ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 415, № 4, с. 556-558
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 576.854 + 577.151.1
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ФОТОТРОФНОЙ ПУРПУРНОЙ НЕСЕРНОЙ БАКТЕРИИ RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS, ТРАНСФОРМИРОВАННОЙ БИНАРНЫМ ВЕКТОРОМ pGA 482 С ГЕНОМ БИОСИНТЕЗА ЦИТОКИНИНОВ ipt
© 2007 г. О. П. Сердюк, Г. Н. Ширшикова, Л. Д. Смолыгина, Е. П. Иванова, Е. Б. Рукавцова, В. В. Алексеева, Г. А. Семенова, Н. Ю. Тарасевич, А. М. Бутанаев
Представлено академиком В.А. Шуваловым 19.02.2007 г. Поступило 27.02.2007 г.
Цитокинины, наиболее важный и широко исследуемый класс фитогормонов, обнаруживаются не только в растениях, но и у представителей самых различных филогенетических групп организмов, от животных [1] до бактерий. Наиболее хорошо цитокинины изучены у микроорганизмов, находящихся в симбиозе с растениями или паразитирующих на них [2]. Нами было показано, что исключение из этого правила представляют фототрофные пурпурные бактерии (ФПБ). Классические цитокинины пуриновой природы не были обнаружены у пурпурной серной бактерии Chromatium minutissimum, а также у несерной Rhodobacter sphaeroides [3, 4]. Зеатинрибозид был найден в клетках ФПБ Rhodospirillum rubrum [5], однако впоследствии в культуральной жидкости этой бактерии цитокинины обнаружены не были [4]. Кроме этого, у ФПБ, геномы которых к настоящему времени определены, не были обнаружены in silico белки, сходные по аминокислотным последовательностям с аннотированными бактериальными и растительными изопентенилтранс-феразами, отвечающими за биосинтез цитокини-нов (неопубликованные данные). Таким образом, в соответствии с полученными данными можно прийти к выводу, что у ФПБ гены биосинтеза ци-токининов отсутствуют или по каким-либо причинам не экспрессируются. В данной ситуации идентификация гена биосинтеза цитокининов у
Институт фундаментальных проблем биологии Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Институт теоретической и экспериментальной биологии
Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
пурпурных бактерий и его продукта - изопенте-нилтрансферазы традиционными методами -ПЦР, определением активности фермента, как это общепринято при определении таковых у бактерий и растений, могли не дать результата. По этой причине было решено трансформировать ФПБ вектором, несущим ген биосинтеза цитокининов, и проследить за изменениями, происходящими в фототрофных бактериях.
Природный механизм переноса в хромосому растительной клетки гена биосинтеза цитокининов ipt, локализованного в Т-ДНК (Трансфер-ДНК), являющегося участком Ti(Tumor-induced) плазмиды Agrobacterium tumefaciens, был сформирован этой бактерией в процессе эволюции. В настоящее время растительные клетки можно трансформировать сконструированными векторами, несущими целевые гены, фланкируемые границами Т-ДНК агробактерий.
В задачи данной работы входило исследование возможности переноса в фототрофную пурпурную несерную бактерию Rps. palustris плазмиды, несущей фрагмент ДНК с геном ipt из супервирулентного штамма A. tumefaciens A281 (pTiBo542), и выявление изменений, происходящих в генетически модифицированной фототрофной бактерии в результате экспрессии гена биосинтеза цитокининов ipt.
В исследованиях была использована фото-трофная пурпурная несерная бактерия Rps. palustris, штамм Км МГУ 285, из коллекции микроорганизмов МГУ им. М.В. Ломоносова. Бактерии культивировали анаэробно фототрофно или аэробно хемотрофно на среде Хатнера [6] с 20 мМ яблоч-нокислого натрия при освещенности 2000 лк и температуре 30°С.
Перенос в фототрофную бактерию Rps. palustris плазмиды pGA-ipt размером 14 т.п.о., сконструированной ранее для трансформации расте-
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
557
ний [7], осуществляли методом конъюгации с бактерией E. coli, штамм S 17, по схеме [8]. Трансформацию конъюгативного штамма E. coli, S17, плазмидой pGA-ipt pGA482 проводили методом электропорации на приборе с контролируемым импульсом (Bio-Rad Gene Pulser) в 0.1-см кювете при значении силы поля 1.75 кВ/см, достигаемом за один импульс на образец. Трансформированные ФПБ и E. coli выращивали на жидких или агаризо-ванных средах Хатнера и Luria-Bertani (LB) соответственно, содержащих селективный маркер тетрациклин в концентрации 13 мг/л. ДНК из бактерий выделяли методом щелочного лизиса [9]. Размер пренесенной в ФПБ плазмиды и ее фрагментов оценивали электрофоретически в агароз-ном геле, сравнивая его с таковыми у исходной плазмиды и маркерами ("килобазной лестницей") (фирма "Сибэнзим", Россия). Колонии фото-трофных бактерий, выращенные на агаризован-ных средах, фотографировали цифровым фотоаппаратом. Экстракцию секретируемых цитоки-нинов и их идентификацию проводили по методикам, описанным ранее [5, 10]. Электронную микроскопию осуществляли на образцах, фиксированных 2.5%-ным глутаровым альдегидом на фосфатном буфере с постфиксацией в 1%-ном тетраоксиде осмия. Спектры поглощения регистрировали на двулучевом спектрофотометре Hitachi 557 (Япония).
Бинарные векторы, несущие целевые гены, фланкированные границами Т-ДНК агробакте-рий, часто используют для трансформации высших растений [11]. В генетической конструкции pGA-ipt, использованной ранее для трансформации растений табака [7], агробактериальный ген биосинтеза цитокининов находится под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S). Эта плазмида стабильно поддерживается и мобилизуется в клетках E. coli и A. tumefaciens благодаря присутствию специфических сайтов в плазмиде широкого круга хозяев pRK2. Известно также, что pRK2 широко используется в качестве челночного вектора для переноса различных генов между E. coli и ФПБ [12, 13]. Плазмида такой конструкции была впервые успешно перенесена методом конъюгации из E. coli, штамм S17, в клетки фототрофной пурпурной несерной бактерии Rps. palustris. Наличие плазмиды в клетках бактерии было подтверждено двумя способами. При посеве трансформированной пурпурной бактерии Rps. palustris на селективную агаризован-ную среду с тетрациклином на чашках вырастали розоватые колонии, в то время как нетрансфор-мированные ФПБ росли только на средах без тетрациклина. Из трансформированных бактерий была выделена тотальная ДНК и перетрансформирована в клетки E. coli, штамм DH 5а. Из E. coli была выделена плазмидная ДНК, ее размер соответство-
вал плазмиде pGA-ipt (14 т.п.о.). Анализ ДНК с помощью ряда эндонуклеаз рестрикции подтвердил, что трансформированные клетки Rps. palustris содержат плазмиду с геном ipt под контролем промотора CaMV 35S.
Среди нескольких способов доказательства экспрессии генов в трансформированных клетках или организмах простыми и надежными являются выделение и идентификация их конечного продукта или выявление специфических для них физиологических эффектов. Поэтому следующим очень важным этапом было исследование состава экзометаболитов трансформированных клеток Rps. palustris и выявление в первую очередь классических цитокининов пуриновой природы, биосинтез которых должен был усилиться благодаря приобретению бактериями гена ipt. Тем не менее, пуриновых цитокининов ни в трансформированных, ни в контрольных клетках Rps. palustris обнаружено не было. Однако в трансформированных клетках, выращенных как хемотрофно, так и фототрофно, присутствовал аденин, причем у фо-тотрофно выращенных бактерий его было в 3.5 раза больше (1.5 мг/л), чем в культуральной жидкости темновой культуры. В контрольных клетках, не содержащих плазмиду pGA-ipt, аденин отсутствовал вовсе. Из литературных источников известно, что регуляцию уровня цитокининов в растениях осуществляет цитокининоксида-за, которая приводит к необратимой деструкции цитокининов с образованием аденина и альдегидов соответствующих изопреноидных остатков [14]. Ее активность возрастает при превышении физиологически необходимого для растения уровня цитокининов. На основании полученных и литературных данных можно предположить, что в трансформированных клетках в отличие от контрольных появление аденина среди экзометаболитов связано с усиленным биосинтезом цитокининов.
Помимо этого, нами были обнаружены и другие существенные изменения в трансформированных клетках по сравнению с контрольными, которые, возможно, обусловлены экспрессией ipt-гена. Известно свойство цитокининов, входящих в состав тРНК, усиливать биосинтез ДНК [15]. На электронномикроскопических снимках было обнаружено большое количество нуклеоидов в трансформированных клетках. Кроме того, электронная микроскопия выявила различия во внешнем виде клеток: трансформированные по сравнению с контрольными были более мелкими и одинаковыми по размеру с широким электроно-плотным слоем по краям. Последнее может свидетельствовать также об изменениях в наружной мембране и клеточной стенке трансформированных бактерий. Подтверждением сказанного могут служить изменения, обнаруженные на фотографиях колоний тех и других клеток: округлых и
558
СЕРДЮК и др.
с вуалью по краю колоний контрольных клеток и островерхих и более мелких у трансформированных. Такие различия во внешнем виде колоний наблюдаются у а-протеобактерий, отличающихся по липополисахаридному составу клеточной стенки.
Ранее нами было показано, что у трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией агробактериального гена биосинтеза цитокини-нов наряду с морфологическими изменениями наблюдается подавление биосинтеза хлорофилла [7]. Этим же свойством обладали трансформированные бактерии Rps. palustris, что, по-видимому, также обусловлено присутствием гена биосинтеза ци-токининов. В полосах поглощения бактериохло-рофилла при 375, 590 нм и в области спектра при 800-900 нм оптическая плотность культур трансформированных и контрольных бактерий при переходе от темновых к световым условиям выращивания была приблизительно одинаковой. Однако в третьем пассаже у фототрофно выращенных контрольных клеток уровень биосинтеза бактерио-хлорофилла выходил на стацион
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.