РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2010, том 4(13), № 2, с. 155-162
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК CD4+CD25+Foxp3+ (Т рег), КУЛЬТИВИРОВАННЫХ EX VIVO, НЕ ОТЛИЧАЮТСЯ ОТ НАТИВНЫХ Т рег
© 2010 г. А.В. Караулов1, С.Н. Быковская2,3, Е.Л. Лысюк3, E. Н. Карандашов 3,
С.К. Соловьёв2, Е.Л. Насонов1,2
1ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва, Россия;
2НИИ ревматологии РАМН Москва, Россия;
3ГОУ ВПО РГМУ им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
Поступила: 01.04.2010. Принята: 13.04.2010
Регуляторные Т-клетки CD4+CD25 + Foxp3+ ответственны за поддержание иммунного баланса в организме и нормальное развитие иммунного ответа. Нативные Т рег расселяются из тимуса на периферию в первые дни после рождения и препятствуют развитию аутоиммунитета. У пациентов с аутоиммунными заболеваниями выявлено редуцированное содержание циркулирующих CD4+CD25+ Foxp3+ T-клеток, что коррелирует с тяжестью заболевания и плохим прогнозом. Дефицит иммуносупрессии при аутоиммунных заболеваниях может быть восстановлен инъекцией Т рег клеток пациента, индуцированных ex vivo. Нами проведено сравнительное изучение количества и супрессорной активности Т рег клеток, свежевыделенных из периферической крови донора и тех же клеток донора, индуцированных ex vivo в результате реверсии и пролиферации пула CD4+ Т-клеток. В результате культивирования CD4+ Т-клеток с ИЛ-2, и костимуляторными молекулами, пропорция CD4+CD25 + Foxp3+ Т рег вырастает в 30 — 40 раз по сравнению с исходным содержанием Т рег в мононуклеарной фракции и в 10—12 раз выше, чем в начальной очищенной популяции CD4+ Т-клеток, использованных для получения Т рег. Экспрессия характерных для Т рег молекул CTLA-4+ увеличивается примерно в 30 раз. Сравнительная оценка супрессивной способности Т рег подавлять пролиферацию обычных CD4+CD25- Т-клеток не выявила различий в популяциях свежевыделенных и культивированных Т рег. Наши данные позволяют заключить, что аутологичные, индуцированные ex vivo Т рег могут быть использованы для адаптивной иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, аллергии, подавления отторжения трансплантата, реакции трансплантат против хозяина.
Ключевые слова: культивирование, регуляторные Т-клетки, CD4+CD25 + Foxp3 +
ВВЕДЕНИЕ
Последнее десятилетие ознаменовалось активным изучением регуляторных СБ4+СБ25 + Рохр3 + Т-клеток (Т рег) и их роли в развитии аутоиммунных заболеваний. Известно несколько субпопуляций Т-клеток, обладающих супрессорной активностью, однако Т рег с чётко выявленными маркёрны-ми характеристиками СБ4+СБ25+Рохр3+ и способностью подавления функции эффек-торных Т и В лимфоцитов, НК клеток и мак-
Адрес: 119992, Москва, Трубецкая, д. 8, стр. 2, ММА им. И.М. Сеченова. E-mail: Karaulov@mtu-net.ru
рофагов являются нативными регуляторны-ми Т-клетками [1 — 3, 7]. Эти клетки имеют тимусное происхождение и расселяются в периферические лимфоидные органы на 3 — 5 день неонатального развития [8]. При дефиците функции тимуса, например, у бестимусных мышей, нарушено образование Т регуляторов, ведущее к появлению диабета I типа, тиреои-дита, гастрита и системного истощения [9].
У человека также выявлена связь между редуцированной функцией тимуса, сниженной генерацией нативных Т рег и появлением аутоиммунных заболеваний. Например, у детей с гипоплазией тимуса в результате де-леции 22д.2 проявляется синдром нарушен-
ной генерации Т рег и повышенный риск развития аутоиммунного расстройства [10]. У больных с мутацией фактора транскрипции аутоиммунного регулятора (AIRE) наблюдается дефективная экспрессия тканеспецифиче-ских аутоантигенов в тимусе, которая ведёт к аутоиммунной полиэндокринопатии [11]. Редукция функции тимуса отмечена у больных рассеянным склерозом и ревматоидным артритом [12].
Как упоминалось выше, основными маркёр-ными характеристиками Т рег служат CD25 + (альфа цепь рецептора ИЛ-2) и продукт гена Foxp3, фактор транскрипции, который ответственен за дифференцировку Т регуляторов
[13]. Мутации Foxp3 у человека приводят к возникновению тяжёлых аутоиммунных патологий. У человека примерно 2% CD4+ клеток экспрессируют Foxp3 и именно эти клетки наиболее ярко окрашиваются CD25+ (hl)
[14]. Активированные CD4+ Т-клетки могут кратковременно экспрессировать CD25+ и Foxp3, однако, экспрессия CD25+ на недавно активированных нерегуляторных Т-клетках обычно ниже, чем на периферических Т рег
[14].
Кроме вышеперечисленных маркёров, на Т рег выявляются рецептор глюкокортико-ид-индуцированного фактора некроза опухоли (TNFR, GITR), антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4) [15], CD62L (CD62 ли-ганд), CD95, мембранно связанный TGFp, рецепторы хоминга лимфоцитов (CD103, CD62L CCR5), и другие маркёры [16].
При аутоиммунных заболеваниях наблюдается количественный и/или качественный дефект Т рег, например, изучены ревматоидный артрит, множественный склероз, миастения гравис, псориаз, аутоиммунный полиглан-дулярный синдром второго типа и системная красная волчанка [5, 6, 16]. Нами ранее исследовано 43 больных СКВ, у которых было значительно редуцировано содержание клеток CD4 + CD25 + CTLA-4+FoxP3+ и снижена их способность подавлять пролиферацию аутологичных CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами [5, 6].
Как известно, для лечения аутоиммунных патологий применяются подавляющие иммунитет препараты (иммуносупресанты), блокирующие активацию и пролиферацию антиген-специфических Т-клеток. Но такие препараты следует принимать постоянно и в течение длительного времени, что неминуемо приводит к интоксикации больного и повы-
шает его восприимчивость к бактериальным и вирусным инфекциям. В связи с этим, в настоящее время предпринимаются попытки индуцировать и поддерживать иммунологическую толерантность при аутоиммунных патологиях с помощью Т рег клеток.
Мы подобрали комбинацию цитокинов и антител, которые обеспечивали успешную генерацию CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-клеток ex vivo. По фенотипическим и функциональным характеристикам клетки, выращенные ex vivo, полностью идентичны натив-ным Т рег, выделенным из периферической крови того же субъекта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проточная цитофлуориметрия
Для цитометрического анализа использовали следующие антитела: FITC (fluorescein 18оШюсуапа1е)-конъюгированные анти-CD3, анти-CD4, анти-CD25; R-PE (R-phycoetythrin)-конъюгированные анти-CD4 и анти-CD8; PE-Cy5 (PC5)-конъюгированные анти-CD19 (Beckman Coulter, France), анти-CD152 [CTLA-4] (BD Pharmingen, USA) и анти^хрЗ (eBioscience, USA), а также соответсвующие изотипические контроли. Для внутриклеточного окрашивания МНК сначала окрашивали антителами к мембранным антигенам (ан-™-CD25-FICT и анти-CD4-PE), фиксировали, пермеабилизировали буфером, содержащим 0,1% сапонина (Fluka, Germany) и окрашивали цитоплазматическими антителами к Foxp3, CD152 или изотипическими контрольными антителами. Цитофлуориметрический анализ производили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson) с использованием программного обеспечения CellQuest Pro.
Выделение Трег из периферической крови
МНК инкубировали с коктейлем меченых биотином антител и анти-биотиновыми микрочастицами (CD4+CD25 + , Regulatory T Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Germany), после чего проводили негативную селекцию CD4+ Т-клеток. Обогащенную негативную фракцию инкубировали с анти-CD25 магнитными частицами, затем собирали и позитивную (CD4+CD25 + ) и негативную (CD4+CD25-) фракции. Для увеличения чистоты клеток
CD4+CD25 + позитивную фракцию выделяли на магнитных колонках дважды. Чистота популяций, определявшаяся методом проточной цитометрии, обычно составляла 90 — 95% для CD4+CD25- и 80-90% для клеток CD4+CD25 + .
Культивирование Трег
МНК выделяли из образцов периферической крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности с использованием среды для выделения лимфоцитов (Lymphocyte séparation medium, MP Biomedicals, USA). Положительную селекцию CD4+ Т-клеток из МНК производили с помощью анти-CD4 магнитных частиц (CD4 MicroBeads, Miltynyi Biotec, Germany). Чистоту выделенных CD4+ клеток оценивали методом проточной цитометрии; обычно она составляла 94-99%. Популяцию CD4+ Т-клеток культивировали в среде RPMI-1640 c L-глута-мином с добавлением 1% раствора пенициллин-стрептомицина (Gibco, UK) и 5% инакти-вированной аутологичной сыворотки донора. В среду добавляли следующие ростовые факторы: IL-2, (R&D Systems, UK), анти-CDS мо-ноклональные антитела (МедБиоСпектр, Россия) и анти-CD28 моноклональные антитела (BD Bioscience, USA). 0,5-1 х 106 клеток/мл культивировали в пластиковых флаконах (Falcon) в течение 6-8 дней, свежую куль-туральную среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 дня. На 6-8 день клетки собирали, подсчитывали их количество и по окраске трипановым синим (Gibco, UK) вычисляли процент мертвых клеток.
Экспансию клеток подсчитывали как количество клеток после культивирования, поделенное на количество клеток до культивирования. Абсолютное количество CD4+CD25 + Т-клеток до и после культивирования вычисляли как произведение общего количества клеток и процента в них CD4+CD25+ дважды положительных клеток, полученного в результате проведения цитометрического анализа.
Смешанная культура лимфоцитов
Аллогенные МНК (выделенные из периферической крови здорового донора) инкубировали с анти-CD3 магнитными частицами (Miltenyi Biotec, Germany), после выделения на магнитной колонке собирали негативную
фракцию. МНК с удаленными CD3+ Т-клетка-ми обрабатывали митомицином С (50 мкг/мл) в течение 45 минут при 37 °C в культуральной среде и тщательно отмывали.
Для всех исследований использовали среду RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 1% раствора пенициллина-стрептомицина и 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Gibco, UK). Культивирование производили в 96-луноч-ных круглодонных платах в конечном объеме среды 200 мкл/на лунку. 5х104 CD4+CD25- и CD4+CD25 + клеток инкубировали в присутствии 5 х 104 аксессорных клеток и анти-CD3 антител (5 цд/ml, MedBioSpectr, Russia). До начала культивирования клетки окрашивали 5 цМ CFSE (F
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.