научная статья по теме ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ»

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 1, с. 70-77

— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ

© 2008 г. Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова, И.К. Богатова

ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»,

Иваново, Россия

Поступила: 17.12.07 г. Принята: 25.01.08 г.

Целью работы было оценить характер иммунных реакций в эндометрии на основании определения особенностей популяционного состава, уровня активации и цитокинового профиля эндометриальных лимфоцитов при сравнении их с аналогичными характеристиками лимфоцитов периферической крови. Было установлено, что в эндометрии снижен уровень Т-лимфоцитов и Т-хелперов, усилена активация лимфоцитов, увеличено количество TCRy5+ лимфоцитов, CD40L+ Т-лимфоцитов и клеток, находящихся на поздних стадиях апоптоза. Эндометриальные лимфоциты характеризовались повышенной экспрессией рецепторов к TGFpl, а также усиленной экспрессией мРНК ИЛ-4, ИФНу, ГМ-КСФ и ФНОр. Выявленные изменения в характере иммунных реакций в эндометрии, с одной стороны, обусловлены функцией эндометрия как барьерной ткани, а с другой стороны, отражают особенности функционирования эндометрия как высокоспециализированной ткани репродуктивного тракта.

Ключевые слова: эндометрий, периферическая кровь, лимфоциты, фенотип, цитокины

ВВЕДЕНИЕ

Эндометрий, представляющий собой слизистую оболочку матки, в настоящее время относят к специфическим барьерным отделам иммунной системы. Принято проводить аналогию между иммунными событиями, происходящими на уровне эндометрия и других слизистых, классическим вариантом которых считается иммунный аппарат слизистых пищеварительного тракта [1]. В то же время эндометрий является высоко специализированной тканью и выполняет ряд уникальных функций, участвуя в регуляции событий, ведущих к наступлению беременности и обеспечивающих оптимальное микроокружение для имплантации семиаллогенно-го эмбриона [2], что определяет особенность иммунных реакций в эндометрии.

Морфологически человеческий эндометрий представлен клетками железистого эпи-

Адрес: 153003, г. Иваново, ул. Красных Зорь, д. 14, кв. 63. E-mail: niimid.immune@mail.ru

телия, гетерологичной стромой и системой сосудов [3], которые подвергаются циклическим изменениям под действием половых стероидных гормонов, различных цитокинов, факторов роста и протеаз. В первую фазу менструального цикла (пролиферативная фаза, 4—13 дни цикла), когда происходит увеличение концентрации эстрадиола в результате развития фолликула, идет пролиферация эндометрия. При овуляции, происходящей на 14 день цикла, формируется corpus luteum и начинает увеличиваться продукция прогестерона, под действием которого происходят изменения, подготавливающие эндометрий к имплантации и беременности, усиливается секреторная функция эндометриальных желез, которая достигает своего максимума к 20 дню цикла. В случае наступления беременности эндометрий трансформируется в деци-дуальную оболочку плаценты, играющую критическую роль в регуляции взаимодействия иммунных систем матери и развивающегося семиаллогенного плода. При отсутствии имплантации наступает менструация, происходящая вследствие отторжения эндометрия,

который регенерирует в следующем менструальном цикле [3].

В норме эндометрий инфильтрирован большим количеством лейкоцитов стромаль-ной и интраэпителиальной локализации [4]. Есть данные, что в эндометриальной строме лейкоциты составляют от 10 до 20% всех стро-мальных клеток [2]. Однако роль иммунной системы в обеспечении регуляции сложного каскада процессов, определяющих нормальное функционирование эндометрия, остается до конца не расшифрованной. Важную информацию о характере иммунных событий в эндометрии может дать проведение сравнительного анализа функционального состояния и уровня активации клеток иммунной системы, инфильтрирующих эндометриальную ткань, с периферическим пулом иммуноком-петентных клеток, что позволит оценить направленность иммунных реакций в эндометрии и приблизит нас к более полному пониманию механизмов функционирования слизистых отделов иммунной системы.

В связи с этим целью данной работы было определить особенности изменения популя-ционного состава, уровня активации и цито-кинового профиля эндометриальных лимфоцитов по сравнению с аналогичными характеристиками лимфоцитов периферической крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

Исследование проводилось на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н. Городкова Росмедтехнологий». В ходе работы были обследованы 30 фертильных женщин, которые не имели гинекологической патологии на момент обследования и обратились в консультационно-диагностическую поликлинику для консультации по вопросам планирования семьи. Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь и биоптаты эндометриальной ткани, взятые в секреторную фазу менструального цикла. Исследования были одобрены локальным этическим комитетом ФГУ «Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий» и проводились с согласия пациенток.

Процедура выделения эндометриальных и периферических лимфоцитов

Выделение обогащенной популяции лимфоцитов из периферической крови проводи-

ли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фи-колл-верографина (р = 1,078). Из образцов эндометриальной ткани проводилось выделение обогащенной популяции мононуклеар-ных клеток (МНК) механическим безфермен-тативным методом. Фрагменты эндометрия отмывали Средой 199, измельчали ножницами, фильтровали через сито из нержавеющей стали и центрифугировали в градиенте плотности фиколл-верографина (р = 1,078). Обогащенную популяцию лимфоидных клеток собирали в интерфазе Среда 199/фиколл-ве-рографин, дважды отмывали Средой 199, доводили концентрацию клеток до 1 х 106 кл/мл и использовали в дальнейшем для проведения цитометрических исследований

Проточная цитометрия

Популяционный состав периферических и эндометриальных лимфоцитов определяли с помощью набора моноклональных антител: анти^45, CD5, CD16, CD25, CD71, CD95, CD38, HLA-DR, коньюгированных с флюорес-цеинизотиоцианатом (ФИТЦ) («Сорбент», Москва) и анти^З, CD4, CD8, CD20, CD154, CTLA-4, CD105, коньюгированных с фико-эритрином (РЕ) (CALTAG Laboratories, USA). Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Апоптоз лимфоцитов оценивали в аннексино-вом тесте с одновременным окрашиванием клеток Annexin V и пропидиумом иодидом (PI) (CALTAG Laboratories, USA). Цитофлюо-риметрический анализ проводили на проточном цитофлюориметре FACScan («Becton Dickinson», USA). Лимфоциты метили CD45 антителами для установления оптимального лимфоцитарного гейта на графике FSC-SSC, который включал более 98% клеток с фенотипом CD45 + . Анализ результатов проводили в программе LYSIS 2.

Проведение ПЦР в режиме реального времени

Для количественного определения экспрессии мРНК цитокинов периферическими и эндометриальными лимфоцитами использовали количественный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Процедуру выделения тотальной РНК из образцов клеток, лизированных в растворе, содержащем гуанидин тиоцианат, цитрат натрия, саркозил и 2-меркаптоэтанол, проводили стандартным гуанидин-тиоциа-нат-фенол-хлороформ методом. РНК перево-

Таблица 1. Сравнительная характеристика фенотипического профиля лимфоцитов периферической крови и эндометрия у здоровых фертильных женщин

Параметр, % Периферическая кровь (л = 30) Эндометрий (л = 30) Р

CD3 + 70,96±1,00 42,87±2,34 < 0,001

CD4 + 40,63±0,85 22,71±1,00 < 0,001

CD8 + 22,09±0,56 22,74±1,14 >0,05

TCR ав + 65,44±2,94 37,24±3,94 < 0,001

TCR yS+ 2,71±0,53 6,05±0,83 < 0,01

CD16 + 14,72±0,75 17,54±1,17 > 0,05

CD56+ 7,66±0,54 9,02±0,89 > 0,05

CD20 + 8,45±0,59 9,54±0,74 > 0,05

CD20 + CD5 + 1,91±0,25 1,94±0,33 > 0,05

CD3 + CD154+ 2,24±0,49 5,88±0,54 < 0,001

дили в комплементарную кДНК, используя рэндом-гексамеры и обратную транскрипта-зу (Perkin-Elmer, Roche Molecular Systems, Inc., NJ, USA). Реакцию обратной транскрипции проводили при 42°C в течение 15 мин с дальнейшей денатурацией при 99°C в течение 15 мин. Для проведения количественной RT-PCR в реальном времени использовались наборы праймеров и зондов, созданных при использовании программного обеспечения PrimerExpress (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) в лаборатории клинической иммунологии университета г. Умео (Швеция), зав. лабораторией — профессор Л. Минче-ва-Нильсон. Количественное определение экспрессии мРНК цитокинов проводили с использованием стандартного протокола TagMan Cytokine Gene Expression Plate (I) (PE Applied Biosystems). Для определения интенсивности флюоресцентного сигнала использовался прибор ABI Prism TM 7700 Sequence Detection System instrument (PE Applied Biosystems).

В каждом образце одновременно определялся уровень экспрессии мРНК исследуемого цитокина и 18S рибосомальной РНК, взятой в качестве гена домашнего хозяйства. Уровень экспрессии специфической мРНК рассчитывали с использованием стандартного полуколичественного Ct-метода (Velden). При этом экспрессия мРНК лимфоцитами эндометрия нормализовалась относительно аналогичных показателей периферической крови, и все результаты представлены как n-кратные различия между соответствующими показателями экспрессии специфической мРНК в лимфоцитах крови и эндометрия.

Статистическую обработку данных проводили с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий между показателями периферической крови и эндометрия определяли по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Данные, характеризующие популяцион-ный состав лимфоцитов периферической крови, и эндометрия здоровых фертильных женщин представлены в таблице 1. Нами было выявлено значительное снижение содержания СБ3+ лимфоцитов в эндометрии по сравнению с показателями крови (р < 0,001). Уменьшение пула эндометриальных Т-клеток происходило за счет СБ4+ лимфоцитов, уро-

вень которых в эндометриальной ткани та

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком