БИОЛОГИЯМОРЯ, 2013, том 39, № 4, с. 287-293
УДК579.22:546.56 МИКРОБИОЛОГИЯ
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ИНДИКАЦИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА МОРСКИЕ ГЕТЕРОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ1
© 2013 г. У. В. Харченко1, И. А. Беленева2, Ю. Л. Ковальчук3, Ле Тхи Ми Хиеп4
1Институт химииДВО РАН, Владивосток 690022;
2Институт биологииморя им.А.В.ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690059;
3Институт проблем экологии и эволюции им.А.Н. Северцова,Москва 119071;
4Приморское отделение совместного Российско-Вьетнамского тропического центра, Нячанг (Вьетнам)
e-mail: beleneva.vl@mail.ru
Статья принята к печати 24.01.2013 г.
Впервые проведена оценка экотоксикологического воздействия тяжелых металлов на дегидрогеназную и ка-талазную активность морских гетеротрофных бактерий в чистых культурах и в ассоциациях. Установлено, что микроорганизмы, выделенные с поверхности медьсодержащих материалов, имеют более высокие показатели ферментативной активности и в меньшей степени подвержены ее угнетению под влиянием токсикантов. Данные полевых и лабораторных исследований свидетельствуют о том, что активность каталазы может служить экологическим индикатором влияния тяжелых металлов на водную среду.
Ключевые слова: каталазная активность, дегидрогеназная активность, тяжелые металлы, экотоксикологи-ческая оценка.
Enzymatic indication of heavy metal toxicity to marine heterotrophic bacteria. U. V. Kharchenko1, I. A. Beleneva2, Yu. L. Kovalchuk3, L. Т. M. Hiep4 ('Institute of Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022; 2A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690059; 3Severtzov Institute of Ecology and Evolution, Russian Academy of Sciences, Moscow 119071; 4Maritime Division ofRussian-Vietnamese Tropical Center, Nha Trang, Vietnam)
The ecotoxicological effect of heavy metals on the dehydrogenase and catalase activities of marine heterotrophic bacteria was assessed in pure cultures and in associations. The microorganisms from the surface ofcopper-containing materials had higher levels of enzyme activity and it was inhibited by trace metals to a lesser degree. The data from the field and laboratory experiments suggest that catalase activity can provide an ecological indicator of heavy metal effect on the aquatic environment. (BiologiyaMorya, 2013, vol. 39, no. 4, pp. 287-293).
Keywords: catalase activity, dehydrogenase activity, heavy metals, ecotoxicological assessment.
Увеличение потребности в эффективных инструментах оценки экологических рисков привело к созданию новых чувствительных детекторов для определения различных токсикантов. Простое измерение в среде концентраций химических соединений, представляющих опасность для ее состояния, не позволяет точно оценить уровень экотоксикологического воздействия и вреда. Вследствие этого при разработке сенсоров, маркеров и детекторов, необходимых для характеристики состояния среды, в последнее время большое внимание уделяется биологическим объектам.
В биомониторинговых исследованиях используются разные виды организмов - от бактерий и диатомовых водорослей до беспозвоночных (Villares et al., 2001; Родичева и др., 2004; Ушева и др., 2006). Экотоксикологические методы, основанные на использовании беспозвоночных, дорогостоящи и трудоемки, для них требуются большие выборки животных. Поэтому разработка быстрых и чувствительных методов экотоксикологической оценки среды с использова-
нием микроорганизмов представляется более перспективной.
Основными функциональными критериями состояния микробиоценозов традиционно считают численность и таксономический состав микроорганизмов. Однако при определении микробиологической агрессивности среды или экотоксикологического воздействия на сообщество микроорганизмов связь между этими параметрами и рассматриваемыми процессами не является прямой и четкой, что было подтверждено результатами исследований (Холоденко и др., 2000; Харченко и др., 2009). Очевидно, более надежными при характеристике экологического состояния среды являются методы, основанные на оценке ферментативной активности микроорганизмов.
В 2009-2010 гг. нами проведена оценка функционального состояния морских микробных сообществ обрастания металлических материалов с использованием метода мультисубстратного тестирования (Беленева и др., 2010). Было показано, что уровень ферментативной
1 Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов ДВО-1 № 09-1-П23-01 и 09-1-П16-04.
активности микроорганизмов является индикатором состояния сообщества в целом и, кроме того, отражает степень взаимодействия микроорганизмов и среды. Это свидетельствует о том, что показатели ферментативной активности сообществ микроорганизмов могут служить критериями оценки состояния среды. В частности, ферментативная активность может отражать интенсивность коррозионных процессов в сообществах обрастания (Харченко и др., 2009) и/или степень токсичности поверхности и, таким образом, может использоваться при диагностике биокоррозионных повреждений и оценке экотоксикологического воздействия антиобрастающих покрытий.
Метод мультисубстратного тестирования представляет собой трудоемкий процесс определения интегрального показателя ферментативной активности микроорганизмов. Поэтому в данной работе был сделан акцент на экспресс-методах определения функционального состояния микробных сообществ в зависимости от уровня загрязнения среды тяжелыми металлами.
В почвенной микробиологии одним из наиболее распространенных индикаторов загрязнения тяжелыми металлами и органическими поллютантами является дегидрогеназная активность микроорганизмов (Ьее й а1., 2002; 1гЬа й а1., 2003; Кш1кае й а1., 2004). Дегидрогеназы, катализирующие реакции дегидрирования органических веществ, высокочувствительны к действию биологических ядов, в присутствии которых активность дегидрогеназ снижается. Чувствительным индикатором состояния среды является также активность ферментов антиокислительной системы - каталаз и пероксидаз. Сообщается, что коррозионные процессы в трубопроводных системах в условиях грунта могут контролироваться с помощью биохимического теста на активность каталазы (Ямпольская, 2005). По мнению Коптевой с соавторами (Коптева и др., 2009), активность каталазы может использоваться для оценки биостойкости изоляционных покрытий как показатель их биодеградации в техногенных средах. Каталаза - фермент, защищающий бактериальную клетку от действия активных кислородсодержащих радикалов и перекиси водорода как эндогенного, так и экзогенного происхождения, она содержится почти во всех аэробных и факультативно-анаэробных бактериях.
Цель данной работы - исследование влияния тяжелых металлов N1, Си, Со, Сё, Zn и РЬ на дегидрогеназ-ную и каталазную активность чистых культур и ассоциаций морских гетеротрофных бактерий для определения индикаторных показателей экотоксикологического состояния микробных сообществ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Воздействие тяжелых металлов на ферментативную активность микроорганизмов оценивали в двух группах экспериментов. Первая группа - эксперименты по определению ферментативной активности биопленок обрастания металлических пластин в морской воде и численности бактерий в био-
пленках. Во второй группе экспериментов изучали каталазную и дегидрогеназную активность отдельных бактериальных штаммов и ассоциаций.
В работе использованы гетеротрофные бактерии, выделенные с поверхности обрастания образцов металлов и сплавов, а также из проб морской воды и охарактеризованные ранее (Беленева и др., 2010, 2011). Металлические образцы меди МЗ, латуни Л63, бронзы БрКМЦЗ-1, цинка, алюминия А5 и нержавеющей стали 12Х18Н10Т размером 75 х 100 х 2 мм выставляли на морском испытательном стенде, расположенном в зал. Дам Бай (о-в Чам, Вьетнам). Срок экспозиции образцов составил 1 мес. Методики соскоба биопленки, приготовления суспензии биопленки и определения численности бактерий на поверхности обрастания металлических пластин описаны ранее (Беленева и др., 2010,2011).
Бактерии и условия культивирования. Для сравнения каталазной и дегидрогеназной активности исследовали две группы бактерий: подвергавшихся длительному токсическому действию меди и не испытывавших такого воздействия. Первую группу составили гетеротрофные бактерии, выделенные с поверхности медных образцов во Вьетнаме: штаммы Bacillus sp. 1266, Pseudomonas fluorescens 1355 и ассоциация бактерий, включающая штаммы Bacillus sp. 1259, Bacillus sp. 1266, Bacillus sp. 1393, P. fluorescens 1355 и Enterobacter sp. 1360 (ассоциация I). Вторую группу составили штаммы, выделенные из морской воды зал. Нячанг (Ruegeria sp. 1444), из морской звезды Distolasterias nipon {Pseudomonas putida 1574) (зал. Восток Японского моря) и ассоциация микроорганизмов из морской воды этого залива (ассоциация II).
Чистые культуры выращивали в течение 36 ч на ага-ризованной среде Ешимицу-Кимура (Youschimizu, Kimura, 1976). Затем готовили концентрат каждой культуры. Для этого выросшую в одной чашке Петри культуру смывали в 10 мл физиологического раствора с pH 7.3. Для получения бактериальной моносуспензии (один штамм) 10 мл бактериального концентрата помещали в 300 мл жидкой морской калиево-дрожжевой (МКД) среды следующего состава: морская вода 1 л, NH4C1 - 1 г, К2НР04 - 1 г, дрожжевая вода - 1 мл, глюкоза -1 г. Для получения суспензии ассоциации I по 2 мл концентрата каждого из пяти штаммов помещали в 300 мл среды МКД. Ассоциация II была получена следующим образом. Аликвоту 0.1 мл морской воды из зал. Восток высевали в чашку Петри с агаризованной средой Ешимицу-Кимура. Через 5 сут роста при комнатной температуре в чашке Петри был сформирован бактериальный газон, представленный разнообразными по морфологии колониями, которые стерильным шпателем переносили в другую чашку с аналогичной средой и растирали по поверхности чашки. Бактериальный концентрат готовили из смеси культур, выросших в чашке Петри через 36 ч, которую смывали в 10 мл физиологического раствора. Для получения суспензии ассоциации II вводили 10 мл концентрата в 300 мл среды МКД.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.