научная статья по теме ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА С УЧАСТИЕМ БИЛИРУБИНОКСИДАЗЫ Химия

Текст научной статьи на тему «ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА С УЧАСТИЕМ БИЛИРУБИНОКСИДАЗЫ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 2, с. 285 - 295

УДК 577.152.192.31;547.99

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА С УЧАСТИЕМ БИЛИРУБИНОКСИДАЗЫ

© 2015 М.Е. Хлупова1, И.С. Васильева1, Г.П. Шумакович1, О.В. Морозова1, В.А. Чертков2, А.К. Шестакова3, А.В. Кисин3, А.И. Ярополов1*

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва; факс: +7(495)954-2732, электронная почта: yaropolov@inbi.ras.ru

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)932-5846, электронная почта: vchertkov@hotmail.com

3 Институт химии и технологии элементоорганических соединений, 105118 Москва; факс: +7(495)913-2538, электронная почта: alshestakova@yandex.ru

Поступила в редакцию 14.07.14 После доработки 10.09.14

Дигидрокверцетин (или таксифолин) — один из важнейших представителей флавоноидов, в большом количестве присутствует в лиственнице сибирской. Исследована окислительная полимеризация дигидрокверце-тина (ДГК) с участием билирубиноксидазы (БОД) в качестве биокатализатора и изучены некоторые физико-химические свойства полученных продуктов. При оптимальных условиях синтеза в результате ферментативной реакции образуются олигомеры ДГК (олигоДГК) с мол. массой 2800 и индексом полидисперсности 8,6. ОлигоДГК растворимы в диметилсульфоксиде (ДМСО), диметилформамиде (ДМФА) и метаноле. УФ-видимые спектры олигоДГК в ДМСО указывают на наличие системы сопряженных связей. Синтезированные олигоДГК были охарактеризованы методами ЯМР и ИК-спектроскопии. Сравнение спектров ЯМР олигоДГК с мономером и родственными флавоноидами показало, что полимер имеет нерегулярную структуру, образующуюся в результате ферментативного окисления ДГК с последующей неселективной радикальной полимеризацией. По сравнению с мономером олигоДГК имеют более высокую термостабильность и обладают высокой антиоксидантной активностью.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дигидрокверцетин, ферментативная полимеризация; билирубиноксидаза, олигомеры, спектры ЯМР 'Н и 13С.

Антиоксиданты осуществляют защиту клеток от повреждающего воздействия свободных радикалов. В последние годы несмотря на то, что антиоксидантные свойства природных фе-нольных соединений (флавоноидов и фитоалек-синов) были известны давно, наблюдается большой интерес к их модификации [1—5]. Это обусловлено не только поиском новых соединений с

Принятые сокращения: DPPH■ — 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил радикал; АБТС — 2,2'-азино-бис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфоновая кислота); БОД — билирубиноксидаза; ДГК — дигидрокверцетин; ДМСО — диметил-сульфоксид; ДМФА — диметилформамид, олигоДГК — олигомеры дигидрокверцетина; ТГА — термогравиметрический анализ.

* Адресат для корреспонденции.

улучшенными антиоксидантными свойствами, но и появившимися сведениями о проявлении этими соединениями широкого спектра фармакологических эффектов, среди которых особый интерес представляют противоопухолевые, антивирусные, антимикробные, противоспали-тельные, ангиопротекторные свойства [6—9]. Кроме того, в литературе приведены данные, которые свидетельствуют о том, что высокомолекулярные полифенольные природные соединения проявляют более выраженные биологические эффекты по сравнению с их мономерами [10—13]. Известно, что низкомолекулярные флавоноиды и фитоалексины разлагаются в организме в течение нескольких часов, в то время как их полимерные производные имеют более длительное время жизни [12].

Флавоноиды — это природные фенольные соединения с относительно низкой молекулярной массой [14]. Природный полифенол дигид-рокверцетин (ДГК), близкий по химическому строению к кверцетину, относится к флавоно-лам. Структурная формула ДГК представлена на рис. 1. В отличие от кверцетина, ДГК не обладает генотоксичностью [15]. Ингибиторные свойства низкомолекулярных флавоноидов, включая ДГК, по отношению к образованию свободных радикалов интенсивно изучали во многих работах [16—19]. Этот флавоноид также укрепляет сосуды и капилляры, подавляет развитие артритов, аллергии, улучшает микроциркуляцию крови [20] и обладает высокой антиоксидант-ной активностью. ДГК включен в Государственный реестр лекарственных средств РФ и разрешен для применения в пищевой промышленности в качестве пищевого антиоксиданта. Однако в настоящее время в литературе нет данных о свойствах продуктов полимеризации ДГК.

Для окислительной полимеризации ДГК в качестве биокатализатора в работе была использована билирубиноксидаза (БОД, билирубин : кислород оксид оредуктаза, КФ 1.3.3.5). Этот фермент относится к медь-содержашим оксидазам и катализирует окисление различных органических соединений, включая фенольные, молекулярным кислородом с сопутствующим восстановлением его до воды по 4-электронному механизму [21]. БОД обладает высокой активностью в области нейтральных значений рН [22]. Эти свойства фермента делают его привлекательным биокатализатором для реализации принципов «зеленой» химии. Использование ферментов в тонком органическом синтезе имеет ряд преимуществ по сравнению с химическим синтезом: реакция протекает в «мягких» ус-

ловиях с высоким выходом целевого продукта и простым выделением его из реакционной среды; отсутствуют токсичные реагенты и побочные продукты; структуру и растворимость конечных продуктов можно контролировать, изменяя условия проведения реакции.

В настоящее время в литературе отсутствуют данные об окислении ДГК, катализируемого билирубиноксидазой, и характеристиках получаемых продуктов.

Целью настоящей работы являлось изучение ферментативной полимеризации дигидроквер-цетина с участием билирубиноксидазы и сравнительная характеристика полученных олиго-мерных продуктов по отношению к мономеру.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дигидрокверцетин (^96%) получен от ЗАО «БиоХимМак-СТ» (Россия) и использован без дальнейшей очистки. Билирубиноксидаза «Ama-no3» из Myrothecium verrucaria («Amano Enzyme Inc.», Япония) была дополнительно очищена методом колоночной хроматографии на носителе Toyopearl DEAE-650M («Tosoh bioscience», Япония). Удельная активность фермента составляла 130 МЕ/мг белка при использовании в качестве субстрата аммонивой соли 2,2'-азинобис-(3-этилбенгзотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС). Однозамещенный фосфат калия, гидроокись натрия, лимонная кислота безводная, диметилформамид, АБТС («Sigma-Aldrich», США), диметилсульфоксид («Марбиофарм», Россия), ферроцианид калия тригидрат (ICN) были использованы без очистки. Пирокатехин («Sigma-Aldrich», США) дополнительно очищали возгонкой в вакууме. Все растворы были приготов-

2 R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = H

3 R1 = R3 = OH; R2 = R4 = R5 = H

4 R1 = R2 = R3 = OH; R4 = R5 = H

5 R1 = R3 = R4 = R5= OH; R2 = H

6 R1 = R3 = R5= OH; R2 = H: R4 = O-Glu-Ram

Рис. 1. Молекулярная структура дигидрокверцетина (1) и родственных флавоноидов (2—7)

лены с использованием воды, очищенной на Milli Q-system («Millipore», США).

Полимеризация дигидрокверцетина. ДГК слаборастворим в воде, однако хорошо растворим в этиловом спирте. Поэтому реакцию полимеризации ДГК проводили в водно-спиртовых растворах при комнатной температуре (20—22°) и атмосферном давлении. В типичном эксперименте 10 мг ДГК растворяли в 0,3 мл перегнанного этилового спирта и рассчитанный объем спиртового раствора флавоноида добавляли к 10 мл 0,1 М K-фосфатного буфера, рН 7,0, таким образом, чтобы концентрация ДГК в полученном водно-спиртовом растворе составляла 3 мМ, а концентрация этилового спирта не превышала 3 об.%. Полученный раствор ДГК интенсивно перемешивали в течение 15—20 мин. Реакцию полимеризации ДГК инициировали добавлением БОД в том же буферном растворе. Удельная активность фермента в реакционной смеси составляла 0,4 МЕ/мл. В отдельном эксперименте было показано, что присутствие 3 об.% этилового спирта уменьшало активность БОД, измеренную по окислению АБТС, на 2—3%. Полимеризацию ДГК проводили в течение 24 ч в аэробных условиях при перемешивании на магнитной мешалке. Активность БОД за время реакции уменьшалась в два раза. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, многократно промывали деионизированной водой, содержащей 3 об.% этилового спирта для удаления непрореагировавшего мономера ДГК, высушивали и использовали в дальнейших экспериментах.

Характеризация продуктов реакции. Мол. массу синтезированных олигомеров ДГК определяли методом гель-проникающей хроматографии на хроматографе высокого давления Waters Alliance GPCV 2000 («Waters», США), оснащенном колонкой PL Gel MIXED-C 300 x 7,8 мм фирмы «Agilent» (США) рефрактометрическим детектором, программным обеспечением Empower Pro version 5.0. В качестве растворителя использовали ^-метилпирролидон. Калибровку системы проводили по полистирольным стандартам.

УФ-видимые спектры олигомеров ДГК записывали на спектрофотометре Shimadzu UV1240 mini (Япония) в растворах ДМСО и ДМФА, а ИК-спектры образцов в таблетках KBr — на спектрометре Frontier FT-IR/FIR («PerkinElmer Inc.», США). Термогравиметрический анализ образцов проводили с использованием термоанализатора NETZSCH STA 409 PC/PG в потоке азота со скоростью изменения температуры 10°/мин.

Спектры ЯМР 1Н и 13С мономера и олигоДГК были зарегистрированы для растворов в ДМСО-Dg

на спектрометре Bruker AVANCE 600 с рабочей частотой для ядер 600,03 МГц.

Антиоксидантную активность измеряли с использованием 1,1-дифенил-2-пикрилгидра-зил радикала (DPPH') по модифицированному методу [23, 24]. Этот радикал имеет максимум поглощения в метаноле при 515 нм [25], которое уменьшается при восстановлении антиоксидан-том. Изменение поглощения в ходе реакции детектировали спектрофотометрически и рассчитывали антиоксидантную активность соединения [23, 24]. К 2,5 мл свежеприготовленного DPPH ' в метаноле (60 мкМ) добавляли различные объемы метанольного раствора исследуемого образца антиоксиданта с известной концентрацией. Регистрировали уменьшение поглощения при 515 нм до выхода на стационарные значения при инкубации в темноте. Ингибирую-щую активность соединения по отношению к свободным радикалам DPPH' рассчитывали по формуле:

% ингибирования =---100%,

где — оптическое поглощение в начальный момент времени, ^25 — поглощение

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком