БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 1, с. 55 - 60
УДК 577.¡52.321.6.14
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ КАК СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ 0-1,3; 1,6-ГЛЮКООЛИГОСАХАРИДОВ В СМЕСИ ЛАМИНАРИОЛИГОСАХАРИДОВ
© 1995 г. Л. А. Елякова, Н. И. Назарова
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток I [оступила в редакцию 28.12.93 г. После доработки 08.06.94 г.
Показано, что прямые зависимости логарифма времени удерживания (т) от степени полимеризации (СП) при ВЭЖХ гомологических серий «-нитрофенилламинари- (Ю^р) и -генциоолигозидов (ё^-'л^Р) имеют разные углы наклона: для значительно больше, чем для Ю„Нр; прямая для
п-нитрофенилгликозидов олигосахарлдов смешанной ¡3-1,3; 1,6-структуры располагается в промежутке между ним». На основании этого предлагается способ качественного обнаружения и полуко-личес.твешюга определения р-1,3; 1,6- г л ю ко о л и го са х а р к до в при использовании их в качестве доноров (акцептор - (Жр) в реакции трансгликозилирования, катализируемой эндо-(3-1,3-глюканазой ЛIV, с последующим ВЭЖХ-анализом образующихся продуктов. В качестве примера проведена идентификация веществ в смесях р-1,3;1,б-глгокотри- и тетрамеров, полученных ферментативным гидролизом различными эмдо-р-1,3-глкжа лазами ламинарана. Показано присутствие в смеси триса-
С
харидов- преимущественно О-О (б'-Р-О-глюкозилламинарибиозы) и небольшой примеси ламина-
С.
ритриозы; в смеси тетрасахаридов - преимущественно ¿-О-в (63-р-У-глкжозилламинаритриозы)
Й
и минорное количество С-¿—О (62-[}-£>-глюкозилламинаритриозы); последняя присутствует также в составе смеси трисахаридов. Данные предлагаемого способа определения состава смесей олигосахаридов (гю полученным из них продуктам трансгликозилирования) подтверждены результатами 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскогощ и данными метилирования.
Ключевые слова: [>1 р, 1,6-глюкоолиюсахариды; эндо-(3-глюканазы; трансгликозилирование; ВЭЖХ.
Реакция трансгликозилирования, осуществляемая ламинариназой J11V (из Spisula sachalinensis), заключается в переносе остатков глюкозы от донора - [3-1,3-глюкана (ламинарана) на акцептор л-ншрофенил-Р-£)-глнжопиранозид (GNp) с образованием н-нитрофенилламинариолигозидов (lG„Np), которые на хроматограмме ВЭЖХ ("Du Pont", Т\'Н2-колонка) представлены в виде çcpnn пиков убывающей интенсивности, соответствующих гомологам: 1G2NP, lG3Np, lG4Np, lG„Np [1, 21. График зависимости логарифма времени удерживания (т) от степени полимеризации (СП) ламина-риолигосахаридов представляет собой прямую линию с определенным углом наклона (рис. 1, прямая б). Времена удерживания н-нитрофенилген-циоолигозидов (gG„Np) на ВЭЖХ-колонке (при тех же условиях хроматографии) значительно больше, и для них подобная прямая имеет больший угол наклона, что установлено из анализа продуктов реакции трансгликозилирования, осу-
ществляемой эндо-(3-1,6-глюканазой пустулана-зой РО в присутствии [3-1,6-глюкана пустулана и ОЫр (рис. 1, прямая а). Для продуктов реакции переноса ламинариназой Л1У [3-1,3-связанных остатков глюкозы из ламинарана на п-нитрофенил-генциобиозид ДО^р) - [3-1.3; 1,6-(Юл§С2Ыр), где расположение (3-1,6-связи на восстанавливающем конце полученных олигомеров предопределено структурой акцептора, прямая от СП попадает, как и ожидалось, в промежуток (заштрихован), ограниченный двумя вышеуказанными стандартными прямыми (рис. 1, прямая в). Это создает предпосылки возможного использования реакции трансгликозилирования для обнаружения и идентификации изомерных [3-1,3; 1,6-глкжо-олигосахаридов в смеси ламинариолигозидов.
Методы разделения изомерных олигосахаридов, число которых с увеличением СП возрастает, разработаны недостаточно. Так, хроматография на бумаге в стандартных условиях
56
ЕЛЯКОВА, НАЗАРОВА
1.3
1.2 [.I
1.0 0.9 0.8
6 СП
Рис. 1. ВЭЖХ продуктом трансгликозилирования, осуществляемого В-1,6-глюканачой РО (пустулгшаэой) (а) а Р 1,3-глюкаиазой ЛГУ (б, е) с использованием в качестве доноров пустулана (а) и ламинараиа (б, в), а в качестве акцепторов л-нитрофекил-Р-О-глюкозида (а, 6) или я-нитрофенилгенциобиозида (а), а также график зависимости I%1 от степени полимеризации (СП) продуктов реакций в системах а - е. Обозначены пики, соответствующие известным образцам: '(-нитрофенол - Мр-ОН, м-нитрофенил-Ё-£>-глюкозид - И^р, н-нитрофенилгенцио- и ламинарнолигосаха-риды: gG2Np и Ю^р (2), gG;í^,p и 10-,Ыр (.?), дО^ГЧр и Ю4Мр (4) и !05Гч'р (5) и их время выхода (т, мин).
(бутанол-пиридин-вода, 6:4:3) позволяет достоверно идентифицировать ламинарибиозу (Ю2), тогда как генциобиоза (£Си) и л а мин ар итриоз а (Ю3) имеют одинаковые Яг Поэтому изомерные три- и тетрасахариды в смеси с серией неразветв-ленных ламинариолигосахаридов бумажной хроматографией практически трудно идентифицировать. Анионообмеиная хроматография серий ла-минари-, генцио- и целлоолигосахаридов [3] в качестве препаративного варианта не подходит, так как разделение ведется в щелочных условиях.
В качестве примера применения предлагаемого метода для идентификации [1-1,3;1,6-глюко-
0 О
1
с-в-о (1) о-с (3) О-О (5)
С О О
1
0-6-0-0(2) О—С—О (4) О -О-О(б) О О- О (7)
0
1
О - глюкоза: С- - р-1,6-связь; О—И - р-1,3-связь
Схема I. Схематическое изображение ясех возможных три- я тетрасахаридов, получающихся при гидролизе используемого ламикарана. Для простоты восприятия генцио-(¡1-1,6)-евязь изображена в виде вертикальной линии независимо от того, как расположена она о цепи: с невосстанавливающего конца молекулы или п виде разветвления.
олигосахаридов мы анализировали продукты реакции ферментативного трансгликозилирования, где донорами служили смеси три- и тетрамеров, накапливающихся (как показано ранее [4]) в результате гидролиза ламинарана ламинариназами ЛГУ и ЛО соответственно (см. схемы 1 и 2). Из схемы 2 следует, что из доноров (1), (2), (5), (6) и (7) в присутствии акцептора н-нитрофенил-(3-0-глю-копиранозида и фермента Л1У могут быть синтезированы только .-¡-нитрофенилламинариолиго-зиды (ЮпМр) (при расщеплении по варианту "а", см. подписи к схемам). При введении в реакцию в качестве доноров олигомеров (3), (4) и (6) после расщепления по варианту "б" должны получаться только (1-1,6; 1 ^-связанные Кр-глюкозиды.
При рассмотрении ВЭЖХ-картин продуктов, образовавшихся в реакции трансгликозилирования трисахаридной фракции (рис. 2), видно, что получены и 1С,Кр, что указывае т на воз-
можное присутствие в исходной смеси тримеров типа (]) и (5) (схема 1), участвующих в качестве доноров. Наличие третьего пика с X 9.08 (рис. 2), идентифицируемо*® как изомер, так как время удерживания его больше, чем у 1С4>{р, и не укладывается на прямую, соответствующую Нр-ла-минариглюкозидам (рис. 2д), свидетельствует, что в реакции трансгликозилирования участвовали, вероятно, соединения типа (4) или (6), дающие (после расщепления по варианту "б", см. схему 2)
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ
57
2 3 4 5 СП
Ряс. 2. ВЭЖХ стандартной смеси Ю„Ыр (г) и продуктов трансгликозилирования, осуществляемого глюканазой ШУ в смеси фракции трисахаридов и СХр, по достижении степени превращения 1.6 («), 3.8 (б) и 8% (в). 11ад пиками - т, мин; д - график зависимости ^ (т, мин) от степени полимеризации для олигосахаридов рис. а - в (/) и г (2).
вЫр 2
10.40
разветвленный тетрамер в качестве продукта реакции.
Состав продуктов реакции трансгликозилирования с тетрамерной фракцией в качестве донора был другим: Ю3Йр и дна вещества с X 9.08 и 9.86, которых попадает (рис. Зг) в "заштрихованное пространство" (рис. 1), соответствующее (5-1,3; 1,6-с'фуктурам. Отсутствие здесь Ю;Кр на всех ста-
диях реакции дает основание предположить, что в тетрасахаридной фракции отсутствуют лами-нариолигосахариды или разветвленные олиго-меры, которые в условиях трансгликозилирования были бы расщеплены по варианту "а". Следовательно, тетрасахаридная фракция была подвергнута трансгликозилированию по варианту "б" (схема 2), в результате чего продуктами могут быть вещества (9) и (10).
вариант "а"
(1) 0-0-0 + О-^'р —- С-О-О-^ + О-в-Кр
(2) с, о с; о + в мр —с-о-в-о -ыр + с-с сч^р + о-в-ыр
в I
(5) о-в + О-Мр — в-о- Np
в
(6) в- С О + в^р—- в-С -Ыр
с
I
(7) в -о-с + о-ыр --- с-с-о-кр + о - о-кР
вариант "б"
в о
I !
(3) в-в + О-Ыр -— С-С-Мр(8)
С ой
(4) в-С-О + С-Ыр— О-О-Ир (8); О-О-О-Ыр (9)
С с
I 1
(6) О-О-с -(- О-Хр — - С-О-в- Лф (10)
Схема 2. Образование продуктов ферментативного трансгликозилирования при использовании доноров - олигосаха-ридов (!) - (7) с их расщеплением по варианту "а" (в линейной цепи или "слева" от разветвления) или по варианту "б" (в линейной цепи или ''справа" от разветвления).
_!_I_I_I_I_
2 3 4 5 6 СП
Рис. 3. ВЭЖХ продуктов трансгликозилирования, осуществляемого глюканазой Л1У в смеси фракции тетрасахаридов и вМр, по достижении степени превращения 1.5 (а), 3.2 (б) и 6.7% (в). Над пиками - т, мин; г - график зависимости ^(т, мин) от степени полимеризации для олигосахаридов рис. а - в (/). На прямой изображены также точки, соответствующие стандартному набору Ю^р (2), ВЭЖХ которого приведена на рис. 2г.
По данные ПМР-спсктра: сигналы аномерных протонов при 8, равных 4.49 м. д. (1Н); 4.69 (1Н); 4.76 и 4.74 (в сумме 1Н); 4.66 и 5.23 (в сумме 1Н) -указывают на наличие в тетрасахаридной фракции тстрасахарида (4) (схема 1) с [3-1,6-связью с невос-станавливающсго конца. Результаты 13С-ЯМР-спе-ктроскопии подтверждают этот вывод: СЗ-ато-мы, участвующие в образовании [3-1,3-глюкозид-ной связи, резонируют при 86.3 (1С); 86.0 и 83.7 м. д. (в сумме 1С). Наличие в спектре сигналов с 8 76 (С5) и 69.9 (С6) м. д. определяет соединение с фрагментом генциобиозы, т.е. тетрасахарид струкч уры (4) (схема 1) составляет 80 - 90% тетрасахаридной фракции. Данные метилирования [5], представленные в таблице, указывают на присутствие в тетрасахаридной фракции двух изомеров ((4) п (6)) с превалированием первого.
В дополнение к этим результатам приводим хроматограммы (рис. 4а - в), выполненные на углеводном анализаторе "ВюПошк". Ранее [6] были подобраны условия разделения на нем смеси Ю2, С1с, §С2 с использованием боратных буферов (врем
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.