ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 546-560
УДК 577.151;579.66
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ р-ЛАКТАМОВ-КИСЛОТ (ОБЗОР) © 2015 г. А. В. Скляренко*, М. А. Эльдаров**, В. Б. Курочкина*, С. В. Яроцкий*
* Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, 117545 e-mail: asklyarenko@yandex.ru **Центр "Биоинженерия" РАН, Москва, 117312 e-mail: eldarov@piengi.ac.ru Поступила в редакцию 08.06.2015 г.
Обсуждаются известные методы ферментативного синтеза Р-лактамов, используемые при этом ферменты и гетерогенные биокатализаторы на их основе, обобщены также имеющиеся в литературе сведения о достижениях в области ферментативного синтеза конкретных антибиотиков, относящихся к пенициллинам-кислотам и цефалоспоринам-кислотам. Проанализированы и сопоставлены ключевые условия и параметры проведения биокаталитических процессов — форма биокатализатора, концентрации исходных соединений, тип растворителя, рН, температура и т.д.; даны рекомендации по дальнейшей оптимизации синтеза Р-лактамов.
Обзор может быть полезен как широкому кругу читателей, так и специалистам-энзимологам и биотехнологам.
Ключевые слова: Р-лактамные антибиотики, ферментативный синтез, цефалоспорины, пенициллины. DOI: 10.7868/S055510991506015X
Р-лактамные антибиотики являются важнейшим классом антибактериальных препаратов, продажи которых достигают 20 миллиардов долларов в год, что составляет порядка 65% общего мирового рынка антибиотиков.
Традиционная классификация Р-лактамных антибиотиков выделяет классы пенициллинов и цефалоспоринов. Она основана на строении так называемых ядер антибиотиков (рисунок), и предусматривает различия в структуре кольца, сопряженного с Р-лактамом [1—3]. Наряду с указанной классификацией известна также классификация Р-лактамных соединений на основании строения их боковой цепи (рисунок), учитывающая, в частности, наличие или отсутствие аминогруппы в а-положении к ациламидной связи, на основании чего выделяют подклассы амино-р-лактамов и Р-лактамов-кислот (БЛК) [4]. Такая классификация учитывает электрохимическую природу антибиотика, что важно при выборе формы готового лекарственного препарата, которая во многом зависит от растворимости исходного соединения при определенном рН. Кроме того, учет кислотно-основной природы соединений крайне важен при разработке технологии получения Р-лактамных антибиотиков, особенно при использовании биокаталитических методов синтеза с последующим выделением целевых продуктов из водной реакционной смеси [5, 6].
К пенициллинам-кислотам относятся природные антибиотики бензилпенициллин (БП), фе-ноксиметилпенициллин и ряд полусинтетических соединений (карбенициллин, оксациллин, метициллин и др.) [4]. Подкласс цефалоспори-нов-кислот включает более полутора десятков полусинтетических парентеральных антибиотиков, примерно половина из которых относится к цефалоспоринам I поколения (цефалотин, цефа-цетрил, цефазолин, ЦЕЗ, цефтезол и др.), другая половина — к цефалоспоринам II поколения (це-фамандол, цефоницид, цефотиам и др.), а антибиотик цефсулодин представляет цефалоспори-ны III поколения [4]. Фармакологические свойства указанных БЛК, механизм их действия, а также взаимосвязь их структуры и биологической активности описаны в работах [3, 4]. Данные о выпускаемых на мировом рынке ß-лактамах с указанием наиболее коммерчески успешных антибиотиков суммированы в ряде обзоров [7—9].
Пути получения полусинтетических БЛК. Основным методом получения полусинтетических ß-лактамных антибиотиков, в том числе БЛК, является химическое или ферментативное аци-лирование ключевых аминокислот (КА), получаемых путем ферментативного гидролиза исходных ß-лактамов (природных антибиотиков или их аналогов), а именно: 6-аминопеницилла-новой, 7-аминодезацетоксицефлоспорановой, 7-аминоцефалоспорановой кислот (6-АПК,
7-АДЦК, 7-АЦК соответственно) и метокси-7-АЦК, а также СЗ-производных 7-АЦК [9—14]. При использовании биокаталитических методов образования ациламидной связи БЛК аци-лирующими агентами (АА) являются карбоно-вые кислоты (КК) или их производные, содержащие фрагмент боковой цепи антибиотика. Ферментативные методы являются безусловно предпочтительными с точки зрения экологической безопасности разрабатываемых на их основе технологий получения антибиотиков, а также чистоты получаемых продуктов [3, 9, 12, 15].
Ферменты биокаталитического синтеза БЛК. Чаще всего при получении БЛК используют широко специфичную пенициллацилазу (ПА) из E. coli, Cluyvera citrophila и других микроорганизмов [9, 16—19]. ПА (КФ 3.5.1.11), используемая во всем мире, прежде всего, для гидролиза природного БП и цефалоспорина G, относится к классу гидро-лаз, подклассу амидогидролаз и является представителем семейства так называемых N-концевых нуклеофильных гидролаз. Фермент представляет собой гетеродимер, состоящий из а- и ß-цепей (23.9 и 61.5 кДа, соответственно), которые удерживаются вместе нековалентными связями [20, 21]. Свойства и применение ПА, в том числе для синтеза ß-лактамов, подробно рассмотрены в обзорах [22-24].
Современные работы по генетике и белковой инженерии ПА нацелены на конструирование новых систем для суперпродукции фермента [25-27]. Каталитические свойства ПА и стабильность фермента изменяют методами направленного мутагенеза [28]. Повышение избирательности и стабильности фермента, способности функционировать в присутствии высоких концентраций органических растворителей достигается также при его иммобилизации [22, 29-33], например на гли-оксил-агарозе [24, 34-36] или путем получения БК в форме поперечно-сшитых ферментных агрегатов [32, 33, 35].
Сложность структуры ПА и недостаточная изученность механизмов формирования и сборки функционально-активного фермента значительно затрудняют разработку эффективных методов его гетерологичной экспрессии. Распространенными проблемами являются невысокий уровень синтеза [37-39], сложности процессов масштабирования ферментации штаммов [40], накопление телец включения и непроцессированного предшественника [41-44]. Приемы, направленные на повышение выхода растворимой и корректно собранной ПА, заключаются в тщательном подборе условий культивирования, коэкспрессии дополнительных белков-шапиронов и процес-сирующих протеаз штамма-реципиента.
Идентичная ПА, так называемая синтетаза це-фалоспоринов-кислот (Cephalosporin Acid Syn-
(a)
X
R1
O
H \
-N.
O
CH3 CH3
COOH
Боковая цепь
Ядро пенициллина (6-аминопенам)
(б)
X
R1
C II
O
H \
-N.
O'
R?
COOH
Боковая цепь Ядро цефалоспорина (3-Я2-7-аминоцефем)
Химическая структура Р-лакгамных антибиотиков: пе-нициллинов-кислот (а) и цефалоспоринов-кислот (б). Стрелкой показана фармакологически важная Р-лак-тамная связь в ядрах антибиотиков. Пунктирной линией показана ациламидная связь, образующаяся при ферментативном синтезе Р-лактамов-кислот. И.! — заместитель в боковой цепи антибиотика; X — заместитель в а-положении к ациламидной связи; К_2 — заместитель в СЗ-положении ядра цефало-споринов.
thetase, CASA), описана у ряда штаммов E. coli [45-49].
Способы биокаталитического синтеза БЛК. Известны два основных подхода — термодинамиче-ски-контролируемый (прямой) и кинетически-контролируемый синтез (синтез с ацильным переносом) [10—12]. В табл. 1 приведены химические структуры БЛК, синтезируемых биокаталитическим путем с использованием одного из указанных подходов.
Термодинамически-контролируемый синтез. Наиболее простым биокаталитическим способом синтеза БЛК является прямое образование ациламидной связи из свободной КК, являющейся в данном случае АА и КА. Реакция синтеза обратима: устанавливается равновесие процессов синтеза и гидролиза антибиотика, контролируемое константой равновесия (Кр), зависящей от температуры и значения рН. Выход продукта прямого синтеза определяется этой константой, то есть является термо-динамически-контролируемым, и, следовательно, при конкретных операционных условиях не зависит от свойств фермента, катализирующего процесс. Тем не менее, активность и стабильность используемых БК небезразличны для достижения высокой эффективности процесса, поскольку трудно
создать условия, обеспечивающие как высокий тер-модинамически-контролируемый выход, так и эффективное функционирование ферментов. В первую очередь, это относится к выбору операционного значения рН.
Показано, что катализирующие прямой синтез ацилазы связывают преимущественно недиссоции-рованные формы реагентов, поэтому эффективность процесса определяется константами ионизации карбоксильной группы АА (К1, АА) и аминогруппы КА (К2, КА), а также решающим образом зависит от операционного рН [50, 51]. Анализ уравнения, описывающего зависимость константы равновесия прямого синтеза от рН показывает, что значение термодинамического рН-оптимума процесса определяется константами ионизации реакционных групп реагентов и примерно равно полусумме их рК: рНопт = (рК1, АА + рК2, КА)/2 [49, 51, 52]. Для большинства БЛК термодинамический рН-оптимум прямого синтеза лежит в области довольно низких значений рН, в то время как область умеренных значений рН, соответствующих максимальной активности и стабильности ферментов, предпочтительна для гидролиза, а не для синтеза антибиотика.
Наиболее эффективен прямой синтез БЛК, содержащих в боковой цепи остатки слабых кислот, например, фенилуксусной кислоты (рК1, ФУК = 4.2 [52], 4.1 [34]) или тиенилуксусной кислоты (рК1, ТУК = 4.15 [52]). Так, с хорошим выходом может быть осуществлен прямой синтез БП (рНопт = 4.45) (например, в работе [53]), цефало-тина (рНопт = 4.30) (например, [54—56]) и цефок-ситина (рНопт = 5.0) [49, 56].
Оптимизация условий синтеза — роль рН. Поскольку рН-оптимум прямого синтеза лежит в области довольно низких значений рН, неблагоприятных для функционирования ацилаз Р-лактамов, предлагаются подходы к повышению эффективности прямого синтеза, основанные либо на сближении операционного рН и термодинамического рН-оптимума, либо на принципе смещении равновесия процесса.
В работах [53, 54, 57, 58] продемонстрировано, что путем использования монофазных вод
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.