УДК 577.1 ¡2,6:577.15234 ¡35
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ АРГИНИНА -ХРОМОФОРНЫХ СУБСТРАТОВ МЕТЛЛЛОПРОТЕИНАЗ
И КАРБОКСИПЕПТИДАЗ
© 1995 г. М. П. Юсупова, Е. К. Котлова, Е. А. Тимохина, В. М. Степанов
Гос И И И генетика, Москва Поступила в редакцию 18.01.94 г. После доработки: 25.02,94 t
Субтилизин 72, сорбированный на поверхности макропористого стекла, в органических растворителях катализирует конденсацию □фиров Ní-ацилированных пептидов с производными аргинина. Сорбированный фермент может быть использован многократно и позволяет синтезировать хромофорные субстраты металлопротеиназ й карбоксипептидаз общей формулы Dnp-Ala-Ala-Xaa-Arg-NH2 (Хаа = Leu, Phe, Val, Не). Металлопротеиназы гидролизуют тетрапептиды по связи А1а-Хаа с отщеплением Dnp-Ala-Ala-OH, определяемого спектрофото метрически. Хромофорные субстраты карбоксипептидаз типа В (Dnp-Ala-Ala-Xaa-Arg-OH и Dnp-Ala-Ala-Arg-OH) получают гидролизом соответствующих амидов трипсином.
Ключевые слова: ферментативный синтез, субтилизин, хромофорный субстрат, металлопро-теиназа.
Специфичность бактериальных металлопроте-Ийаз (КФ 3.4.24) определяется структурой аминокислотного остатка, занимающего Р, -положение в молекуле субстрата [1]. С наибольшей скоростью расщепляются связи, образованные а-ами-ногруппой гидрофобных аминокислот фенилала-нина и лейцина, и меньшей степени - валина и изолейцина [2]. Для определения активности этих ферментов была предложена серия субстратов общей формулы Dnp-Gly-Gly-Xaa-Arg-OH, синтезированных традиционными методами пептидной химии [3]. Металлопротеиназы расщепляют связь Gíy-Xaa, высвобождая при этом дипептид Drtp-Gly-Gly-OH, который может быть количественно отделен от избытка субстрата и определен спектрофотометрически. Однако такие субстраты имеют на конце свободную карбоксильную группу, что делает их уязвимыми к действию карбоксипептидаз, которые могут сопутствовать ме-таллопротеипазам.
Нами получена серия субстратов, лишенных этого недостатка, общей формулы Г)пр-А1а-А1а-Xaa-Arg-NH2 (I), где Хаа = Leu (a), Phe (б), Val (в), De (г). Амидирование С-концевого остатка аргинина предотвращает его отщепление карбоксипепти-дазами. Другая серия субстратов - Dnp-Ala-Ala-Xaa-Arg-OH (На - г), а также Dnp-Ala-Ala-Arg-OH (III)
Сокращения: Йпр - 2,4-динитрофенил, ОМЭО - диметил-сульфоксид. Все аминокислоты - ¿-ряда. Адрес для переписки! 113545 Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1, ГоеНИИгенетика, В.М. Степанову.
могут быть использованы для определения активности карбоксипептидаз В, 14, Т и их аналогов. Для получения Ппр-пептидов разработан двухста-дийный ферментативный синтез. На первой стадии Опр-А1а-А1а-ОН (IV) вводят в реакцию с метиловым эфиром лейцина (а), фенилаланина (б), валина (в) или изолейцина (г) в присутствии термолизина как катализатора (мольное отношение Е : Б = 1 : 104), следуя методу, описанному ранее для бепзилоксикарбонилпептидов аналогичной структуры [4]. Например,
_ термолизин
Опр-А1а-А1аОН - НЛ.еи-ОСН, —--
(IV)
Опр-А1а-А1а-Ьеи-ОСН,
(Ы
Схема 1.
Равновесие этой реакции сдвигается в сторону синтеза благодаря выпадению продукта в осадок. Выходы продуктов реакции Опр-А1а-А1а-Хаа-ОСН3 (Уа - г) составили 76% для соединений (Уа) и (Уб), 73% для (Ув) и 50% для (Уг).
На следующей стадии эфиры (Уа - г) в смеси ЮМвО и ацетонитрила, содержащей не более 0.1% воды, вводили в реакцию с амидом аргинина в присутствии субтилизина 72, сорбированного на макропористом стекле СРО-Ю [5], что обеспечивает
%
(а) 100
ВЭЖХ-контроль синтеза пептидов Dnp-Ala-Ala-Leu-Arg-NH2 (la) (а) и Dnp-Ala-Ala-Phe-Arg-NHj (¡б!1 (б). Приведены кривые накопления продуктов (1а, б) (/), (Via, б) (3) и расхода эфира (Va, б) (2). Условия синтеза см. в "Экспер. части" и табл, 1.
стабильность фермента в присутствии органических растворителей:
Спр-А1а-А1а-Хаа-ОСН3 + Н-Агё-1ЧН2 -субтили;ин-(V)
субтилиз""> Опр-А1 а-А! а-Хаа-А^-КН, (I)
Схема 2.
Реакция между эфирами Опр-пептидов и амидом аргинина протекает, очевидно, по схеме 3:
Опр-А1а-А1а-Хаа-ОС1-Ь + Н-О-Е —~
(V)
—- [0пр-А1а-А1а-Хаа-0-Е]
H-Arg-NH 2
Н,0
— Dnp-Ala-Ala-Xaa-OH
(VI)
Опр-А1а-А1а-Хаа-Агн-ЫН7
(I)
Схема 3.
Здесь Н-О-Е - фермент со свободной гидроксидь-ной группой серина в активном центре.
Ускорение образования ацилфермента и направленность всего процесса в сторону образования пептидной связи обеспечивались использованием в качестве ацитирующих компонентов метиловых эфиров пептидов. Образующийся на промежуточной стадии процесса ацил фермент (схема 3) может реагировать как с аминокомпо-нентом, давая желаемый продукт, так и с водой, что приводит к снижению выхода основного вещества. Варьируя концентрации амида аргинина и воды в реакционной смеси, можно направить
реакцию в ту или иную сторону. Для получения высокого выхода Dnp-тетрапептида оптимален 1,5-кратный избыток аминокомпонента, поскольку не вступивший в реакцию амид аргинина легко отделяется от заметно более гидрофобного Dnp-пептида. Дальнейшее увеличение избытка аминокомпонента не вызывает заметного ускорения процесса. При эквимольном соотношении реагентов скорость накопления продуктов существенно снижается и их разделение усложняется.
Степень гидролиза ацилфермента можно понизить, уменьшая концентрацию воды в системе, т.е. используя "сухие" растворители (в нашем случае 35% DMSO и 65% ацетонитрил. Надо отметить, что в реакции помимо той воды, которая содержится в растворителях, может участвовать и вода, имеющаяся на поверхности фермента и макропористого стекла). В этих условиях амиды Dnp-тетрапептидов (1а, б) были получены с выходом 90 - 94% (табл. 1). Гидролиз эфиров Dnp-пептидов в таких условиях незначителен, и даже после продолжительной инкубации выход Dnp-Ala-Ala-Leu-OH (Via) составляет всего 6%, а Dnp-Ala-Ala-Phe-OH (VI6) - 9%. Вторичного гидролиза ферментом пептидного продукта не наблюдается, что также объясняется низким содержанием воды в реакционной среде. Как показано на рисунке, кривые расхода эфиров трипептидов (2) и накопления продуктов (/) практически симметричны, при этом основное количество соединения (1а) накапливается в смеси в течение 1 - 2 ч и выход медленно приближается к 94% за сутки (рисунок, а). Кривая же накопления (16) (рисунок, б) отличается более пологим наклоном, и основное количество продукта образуется несколько мед-
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ АРГИНИНА
35
леннее (за 3 - 4 ч). Надо отметить, что добавление в систему 1 - 2% воды резко увеличивает скорость синтеза тетрапептидов (I), по-видимому, за счет возрастания активности фермента, однако одновременно возрастает скорость гидролиза исходных эфиров (V).
По-видимому, присутствие органических растворителей не изменяет заметным образом субстратную специфичность субтилизина 72 - фермента, подобного субтилизину Carlsberg. Данные, представленные в табл. ! и на рисунке, показывают, что в положении наиболее предпочтителен остаток лейцина, несколько хуже с участком S, фермента связывается остаток фенилаланина. Остатки валина и изо лейцина, имеющие в боковой цепи ß-разветвленные радикалы, наименее подходят для размещения в подцентре 5, субтилизина [6-9]. Низким сродством этих аминокислот к биокатализа гору можно объяснить существенно меньшую скорость синтеза и низкие выходы соответствующих продуктов (1в, г), которые удается повысить только путем увеличения содержания фермента в реакционной смеси. При этом, однако, процесс усложняется тем, что получающиеся производные (1в, г) могут вступать в реакцию со второй молекулой амида аргинина, образуя необычные продукты - Dnp-Ala-Ala-Val(Ile)-Arg-Arg-NH2. Эта реакция будет подробно рассмотрена в последующих публикациях.
В выбранных нами условиях (Е : S = 1 : 500) практически не наблюдается образования амида трипептида (III) - Dnp-AIa-Ala-Arg-NH2 (VII) из Dnp-Ala-Ala-ОСНд (VIII) и амида аргинина (схема 4). В этом случае положение Р} в субстрате занимает остаток аланина, который связывается с подцен-тром 5! субтилизина существенно слабее объемных остатков лейцина и фенилаланина [9]. Кроме того, дипептиды име1рт менее протяженный участок связывания, чем трипептиды. Однако отрицательное влияние слабого связывания исходного субстрата с ферментом на скорость реакции и в этом случае удается компенсировать увеличением содержания фермента в реакционной среде (табл. 1).
Поскольку в качестве катализатора используется фермент, сорбированный на твердом носителе, говорить о его объемной концентрации нельзя. Приводимые мольные отношения фермента и субстрата, на первый взгляд, указывают на необычно низкую эффективность катализатора, что может быть, в частности, обусловлено непродуктивной ориентацией фермента на поверхности носителя, При увеличении содержания фермента (до мольного соотношения Е : S = 1 : 110) удается провести синтез трипептида (VII) в органических растворителях без добавления воды с выходом 25 - 30% за 24 ч. При этом гидролиз карбоксильного компонента составляет 4-5%, Добавление в
Таблица 1, Синтез Dnp-пептидоа Dnp-AIa-Ala-Xaa-Arg-NH2 (Ia - г), катализируемый субтилизином 72 (см. схему 3)
(Мольное соотношение Е ; S = 1 : 500 в смеси DMSO-ацетонитрил 35 : 65, содержание поды < 0,1%)
Хаа в Время Содержание в смеси, %
пептиде реакции,ч (I) (V) (VI)
Leu (а) 23 94 0 6
Phe(б) 23 90 1 9
Val (в) 450 33 62 5
Val* (в) 48 50 31 8
Не (г) 96 10 86.3 3.7
11с* 66 26.6 57.6 3.3
_ * * 48 79.2 7.8 13
* Мольное соотношение Е : S = 1 : 150. ** Мольное соотношение Е : S = I : 110; содержание водь: 2%.
реакционную смесь 2% воды приводит к 70% выходу соединения (VII) и образованию 10 - 12% Опр-А1а-А1а-ОН (IV):
Опр-А1а-А!а-ОСН э + А^-Ш2 — (VIII)
— Опр-А1а-А1а-А^-МН2.
(VII)
Схема 4,
Очевидно, введение небольшого количества воды в реакционную среду позволяет заметно повысить эффективность сорбированного на пористом носителе фермента, вследствие чего скорость накопления продуктов синтеза возрастает в 2 раза.
Сорбированный на макропористом стекле субтилизип достаточно стабилен, если органические растворители содержат 1 - 3% воды. В таких условиях с одним и тем же препаратом сорбированного субтилизина можно провести н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.