МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 2, с. 171-177
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 577.151
ФЕРМЕНТЫ КСИЛОТРОФНОГО БАЗИДИОМИЦЕТА LENTINUS EDODES F-249 В ПРОЦЕССЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ
© 2008 г. Е. П. Ветчинкина1, Н. Н. Позднякова, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия
Поступила в редакцию 18.06.2007 г.
Показано, что при твердофазной ферментации сусло-агарового субстрата гриб Lentinus edodes продуцирует внутриклеточные ферменты, включая Mn-пероксидазу, лакказу и тирозиназу в виде семейства изоформ. Состав комплекса менялся в процессе жизненного цикла базидиомицета и содержал от одной до четырех форм каждого фермента. Активность оксидаз была максимальной на стадии непигментированного мицелия, а также на стадии коричневой мицелиальной пленки и плодового тела. Активность тирозиназы возрастала по мере пигментирования мицелия и имела два максимума - на стадии коричневой мицелиальной пленки и на стадии плодового тела. Обнаружено, что при добавлении в среду культивирования экстракта из дубовых опилок резко возрастает активность лакказы и тирозиназы по сравнению с активностью ферментов мицелия, выращенного только на сусло-агаре. Установлено, что в результате воздействия субстратов фенолоксидаз на растущий мицелий происходит ускорение процесса морфообразования у гриба L. edodes в 2 раза.
Ключевые слова: стадии морфогенеза, Lentinus edodes, лакказа, тирозиназа, Mn-пероксидаза.
Развитие грибных организмов происходит в непосредственном контакте с внешней средой, поэтому они являются постоянными объектами стрессоров физической и химической природы, которые запускают процессы дифференцировки у грибов. В процессе развития под влиянием внешних факторов наряду с анатомической диф-ференцировкой происходит и "химическая диф-ференцировка", то есть в ответ на стресс идет формирование новых метаболических путей. Известно, что у многих грибов прекращение роста и переход к стационарной фазе сопряжен с биосинтезом вторичных метаболитов. Вещества вторичного происхождения не свойственны животным, однако присущи микроорганизмам, растениям и грибам. Биосинтез вторичных метаболитов представляет собой один из многих процессов, сопровождающих клеточную дифференцировку [1]. Молекулярные механизмы, лежащие в основе обоих процессов - дифференцировки и синтеза вторичных метаболитов, еще далеко не расшифрованы, но очевидно, что появление вторичных метаболитов тесно связано с функционированием ферментов, чей синтез и активация индуцированы действием стрессовых факторов [2].
Ксилотрофные базидиомицеты - группа высших грибов, занимающих важное место в структуре растительных и лесных биоценозов, поскольку основная их функция - деструкция лигно-целлюлозных субстратов. Эти грибы привлекают
1 Адресат для корреспонденции (elenavetrus@yandex.ru).
внимание как участники процессов биодеструкции растительных отходов, а также как продуценты ферментов и уникального комплекса биологически активных веществ [3]. Лакказы, Mn-перокси-дазы и тирозиназы распространены у ксилотрофов, они участвуют в деградации лигноцеллюлозных субстратов, синтезе пигментов и меланинов [4-6]. Большинство базидиомицетов относится к грибам белой гнили, обладающих лигнолитическим ферментным комплексом, основными ферментами которого являются Mn-пероксидаза и лакказа. Выделяясь в окружающую среду, эти ферменты участвуют в деградации лигнина, синтезе и деструкции гуминовых веществ [7, 8].
Важные физиологические и биосферные функции лакказ, Mn-пероксидаз и тирозиназ обусловливают необходимость не только изучения участия данных ферментов в биохимических реакциях деструкции лигноцеллюлозных субстратов, но и выявления их роли в метаболизме грибов, в особенностях цитодифференцировки.
Особый интерес к Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] (шиитаке) обусловлен не только большой пищевой ценностью и вкусовыми качествами плодовых тел, но и получением из этого ксилотрофного базидиомицета целого ряда ценных медицинских препаратов, показавших себя как незаменимые лекарственные средства, не оказывающие токсического действия на организм больного [9-12]. Несмотря на это, в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют данные по обнаружению и изучению
внутриклеточных ферментов, характерных для определенных морфологических структур этого гриба.
В задачу данного исследования входило изучение состава внутриклеточных фенолоксидаз, синтезируемых грибом L. edodes на стадиях морфогенеза, специфичных для данного вида гриба, с целью выявления ферментов, характеризующих данные морфологические структуры.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Гриб и условия культивирования. В работе использовали базидиомицет Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] (шиитаке) F-249 из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета. Грибную культуру поддерживали на сусло-агаре при 4°С.
Для твердофазного культивирования L. edodes использовали среду с агаризованным пивным суслом (4° по Баллингу), а также сусло-агаровую среду с добавлением дубового экстракта [13]. Экстракт получали следующим способом: сухие дубовые опилки заливали водой (100°C) и оставляли на ночь при комнатной температуре, фильтровали, автоклавировали 30 мин при 0.5 атм, 10% экстракт добавляли в среду культивирования. Культивирование проводили на чашках Петри при оптимальной температуре роста мицелия для данного вида, которая составляет 26°С [14].
В исследовании использовали непигментиро-ванный мицелий L. edodes на 7, 14 и 28 сут культивирования, пигментированный мицелий (40 сут), коричневую мицелиальную пленку (50 сут), при-мордии (60 сут) и плодовые тела. Плодовые тела L. edodes образовывались на чашках Петри с сусло-агаром на 60-70 сутки после инокуляции [15].
Обнаружение оксидазной активности в процессе роста мицелия. Качественное обнаружение оксидазной активности у гриба L. edodes было проведено на чашках Петри при твердофазном культивировании на среде с агаризованным пивным суслом (с добавлением дубового экстракта и без него) на 7, 14 и 28 сут. На поверхность растущего мицелия наносили раствор 2,2'-азино-бмс(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната) (AБTС) в 50 мМ Na-тартратном буфере (pH 4.5). Окисление АБТС определяли по появлению зеленого окрашивания мицелия [16]. Дополнительно проводили тест на наличие активности оксидаз с использованием 0.2% диметоксифенола (ДМОФ) [17] и 0.02% си-рингальдазина [18]. Наблюдали за появлением коричневой окраски мицелия в первом случае и ярко-розовой во втором.
Условия выделения ферментов. Для получения внутриклеточных ферментов гриб выращи-
вали до определенной стадии морфогенеза, отделяли от среды культивирования, промывали дистиллированной водой, высушивали при 25°С до постоянной массы, взвешивали, механически измельчали, разрушая клеточную оболочку при помощи фарфоровой ступки, пестика и кварцевого песка, экстрагировали ферменты из расчета 20 мг гомогенизированного сухого мицелия на 2 мл 20 мМ Na-K-фосфатного буфера (pH 6.0) в течение 2 ч, гомогенат осаждали центрифугированием при 12000 g 15 мин, отделяли супернатант от осадка и фильтровали.
Для получения внутриклеточных ферментов из сырого мицелия гриба использовали аналогичную методику, но экстрагировали ферменты 2 мл 20 мМ Na-K-фосфатного буфера (pH 6.0) из 800 мг сырого гомогенизированного мицелия, так как в процессе сушки масса мицелия уменьшалась в 40 раз.
Определение ферментативной активности. Активность ферментов определяли при 18°С на приборе Specord M 40 ("Carl Zeiss", Германия). Активность лакказы определяли по скорости окисления 0.2 мМ AETC ("Sigma", США) в 50 мМ Na-тартратном буфере (pH 4.5). Окисление АБТС до устойчивого катион-радикала измеряли по увеличению поглощения при длине волны 436 нм (е436 29300 М-1 см1) [17]. Активность Mn-пероксидазы определяли по скорости окисления 0.2 мМ AETC ("Sigma", США) в 50 мМ Na-тартратном буфере (pH 4.5) с добавлением к реакционной смеси 0.1 мМ Н2О2 и 0.2 мМ Mn(2+). Окисление АБТС до устойчивого катион-радикала измеряли по увеличению поглощения при 436 нм (е436 29300 М-1 см1) [19].
Активность тирозиназы определяли по скорости окисления 2 мМ L-дигидроксифенилаланина (L-DOPA; "Serva", Германия) в 50 мМ mpuc-HCl буфере (pH 7.5). Окисление L-DOPA до "допа"-хи-нона измеряли по увеличению поглощения при 475 нм (е475 3700 М-1 см-1) [20].
Время реакции во всех случаях 5 мин. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкмоль субстрата или образование 1 мкмоль продукта в минуту, и выражали как мкмоль мин-1 мг-1 белка.
Определение белка. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [21].
Электрофорез в полиакриламидном геле. Исследование состава белков, полученных при экстракции на каждой стадии развития гриба, проводили методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в неденатурирующих условиях (без добавления ДДС-Na и Р-меркаптоэта-нола) [22]. Визуализация белков осуществлялась окрашиванием Coomassie Blue R-250.
Специфическое окрашивание ПААГ для проявления оксидаз проводили в реакционных смесях следующего состава: 1% уксусная кислота (1 мл);
0.2% орто-дианизидин (50 мг); 50 мМ №-тартрат-ный буфер (pH 4.5) (50 мл). Красно-коричневое окрашивание полос, соответствующих лакказе, проявляется в течение 15 мин инкубации геля в реакционной смеси [23].
Для окрашивания ПААГ на активность Mn-пе-роксидазы в состав выше описанной реакционной смеси дополнительно вносили 0.1 мМ Н2О2 и 0.2 мМ MnSO4. Красно-коричневое окрашивание полос, соответствующих Mn-пероксидазе, проявляется в течение 20 мин инкубации геля [19].
Для окрашивания ПААГ на активность тиро-зиназы использовали реакционную смесь следующего состава: 10 мг Ь-ДОПА и 50 мМ трuc-HCl буфер (pH 7.5) (25 мл). В течение 10 мин проявляются зеленовато-коричневые полосы, соответствующие тирозиназе [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оксидазная активность растущего мицелия Ь. вйойвз. Наличие оксидазной активности по способности окислять AБTC, диметоксифенол и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.