БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.6, c.1012-1014
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 578.088
ФИБРИЛЛЯРНАЯ ЧАСТЬ ФАКТОРА С^ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА СОДЕРЖИТ БОЛЬШОЕ КОЛИЧЕСТВО
СВЯЗАННОЙ ВОДЫ
© 2009 г. В.М. Тищенко
Институт биологического приборостроения РАН, 142290, ПущиноМосковской области
Поступила в р едакцию 17.01.2009 г.
Методами аналитического центрифугирования определена молекулярная масса фрагмента ^СЦ-СЬИ) фактора системы комплемента СЦ, представляющего собой коллагеновую мини-фибр иллу. Показано, что эта масса заметно пр евышает ту величину, которую можно ожидать, исходя из аминокислотного и углеводного со става. Ф рагменты 8С^-СЬИ также имеют аномально высокий удельный парциальный объем. Эти данные подтверждают предложенную ранее модель, согласно которой фрагмент содержит большое количество связанной воды.
Ключевые слова: фрагменты С1д, молекулярная масса, связанная вода.
К-концевые части всех 18-ти полипептидных цепей фактора системы комплемента С^ имеют последовательность аминокислот коллагеново-го типа. Они образуют шесть коллагеновых спиралей, N-концевая часть которых ассоциирована в минифибриллу [1,2]. Было показано, что часть удельной энтальпии денатурации и скачка теплоемкости можно объяснить большим содержанием связанной воды в фибриллярной части [3]. Такая вода должна быть прочно связана с белковой матрицей. Подобная модель предсказывает, что молекулярная масса фибриллярной части С^ должна быть значительно больше, нежели это следует из прямого расчета по известному аминокислотному и углеводному составу полипептидных цепей. Наличие связанной воды должно влиять также на величину удельного парциального объема.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Интактный фактор С^ системы комплемента был получен из плазмы крови человека по методике, описанной в работе [1]. Ф рагмент, представляющий собой фибриллярную часть белковой молекулы С^, ассоциированную в коллагеновую минифибриллу ^С^-СЬИ), был получен с помощью протеолиза. Последовательно применяли пепсин [2,3] и Т РСК-тр ипсин (трипсин, обр аботанный Ь-(1-тозиламидо-2-фе-нил)этилхлорометилкетоном) [4].
Молекулярную массу белков определяли на аналитических ультрацентрифугах «Весктап» (модель Е) и «МОМ» равновесными методами (высокоскоростным [5] и низкоскоростным [6]).
Спектры белков в инфракрасной области регистрировали в тяжелой воде на ИК-спек-тр офотометре (Zeiss UR-10), как это было описано в работе [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Применение метода аналитического ультрацентрифугирования является наиболее адекватным подходом для определения массы натив-ного белка в водном растворе. Наиболее точные данные пр и этом можно получить, используя высокоскоростное равновесное центрифугирование и анализируя полученные экспериментальные результаты, с помощью подхода, предложенного в работе [5]. Однако применение этого подхода для исследования С^-СЬИ-фраг-мента, который представляет всю коллагеновую часть белка, сопряжено с техническими трудностями. Коэффициент диффузии фрагмента мал из-за большой массы белка и его асимметричной формы. Это приводит к непозволительно большим временам установления равновесия в процессе центр ифугирования. Поэтому для дальнейших исследований был выбран sClq-CLR-фp агмент. Меньшая масса этого белка и меньшая асимметрия его структуры позволили, во-первых, использовать оба равновесных метода (высокоскоростной и низкоскоростной). Во-вторых, удалось применить такую модификацию наиболее точного высокоскоростного метода, которая позволяет определить обе неизвестные величины - и саму массу и удельный парциальный объем [8]. Для этого
ФИБРИЛЛЯРНАЯ ЧАСТЬ ФАКТОРА C1q СИ C ТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА 1013
эксперименты проводили как в обычной, так и в тяжелой воде.
Центр ифугир ование в тяжелой воде пр оводили после пр едвар ительной инкубации в ней 8СЦ-СЬЯ-фрагмента при 30°С в течение 30 часов. В этих условиях пр оисходит полное замещение всех лабильных атомов водорода на дейтер ий, что было подтвер ждено ИК-спектр о -фотометрией. При этом молекулярная масса должна была возр а сти в 1,0823 р аза. Ра счет молекулярной массы и удельного парциального объема пр оводили по фо рмулам:
М (1 - vp1) = 2ЯТйп с/йт2
кМ (1 - ур2) = 2Я Тйп с/йт2,
где М - молекуляр ная ма сса; V - удельный пар циальный объем; р1, р2 - плотно сти ра ство-рителя (1,0235 и 1,1075 мг/мл для обычной и тяжелой воды); Я - газовая постоянная; ш -угловая скор о сть вр ащения р отор а, рад/с; с -смещение интерференционной полосы по оси у; т - р адиус вр ащения.
На рисунке пр иведены результаты экспер и-мента. Вычисления по пр иведенным ур авнениям дают для молекуляр ной ма ссы 8СЦ-СЬЯ значение 98 ± 4 кДа (вместо значения 78 кДа, полученного согласно пр ямому расчету), а для удельного пар циального объема - 0,735 ± 0,005 см 3-г-1 (0,701 см 3-г-1, полученного согласно пр я-мому р а счету). Дополнительные экспер именты по низкоскор о стному р авновесному центр ифугир ованию также показали равенство средне-весовой массы и г-массы фрагмента (98 ± 4 кДа и 101 ± 8 кДа соответственно). Это свидетельствует об отсутствии агр егатов в исследуемом обр азце 8СЦ-СЬЯ. С ледовательно, ука -занный эффект обусловлен о собенностями внутр имолекуляр ной о р ганизации фибр илляр ной части СЦ. На роль таковой может претендо-вать только полость в фибриллярной части СЦ, возникающая в результате ассоциации шести коллагеновых спиралей и заполненная водой. Конформация поли-Ь-пролиновых спиралей позволяет, как показывает стереохимический анализ, служить им своеобр азной платформой для формирования льдоподобной структуры воды, а практическая замкнутость объема позволяет не огр аничиться слоем струк -турированной воды на внутренней цилиндрической поверхности, а формировать объемную
Опр еделение молекуляр ной массы субфр агмента 8С^-СЬЯ методом высокоскор о стного центр ифугир ования в обычной (светлые кр ужки) и в тяжелой (темные кружки) воде, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,5 (рБ 7,2), 20°С, ш = 27440 об /мин. Наклон (й1пс/йт2) составляет 2,34 и 2,11 для обычной и тяжелой воды соответственно.
льдоподобную структуру [1]. Наличие такой стр уктур ы позволяет планир овать ряд нанотех-нологических задач.
Работа выполнена пр и финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, гранты 98-0449123-а и 04-04-97254-р2004наукогр ад-а
СПИС ОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. V. M. Tisdenko, A. M. Idtdenko, С. V. Andreyev, and A. V. Kajava, J. Mol. Biol. 234, 654 (1993).
2. B. Brodsky-Doyle, K. R. Leonard, and K. B. M. Reid, Biodem. J. 159, 279 (1976).
3. E. Kildherr, H. Hofmann, W. Steigemann, and J. Engel, J. Mol. Biol. 186, 403 (1985).
4. S. Ruiz, A. H. Hensden-Edman, and A. J. Tenner, J. Biol. dem. 270. 30627 (1995).
5. D. A. Yphantis, Biodemistry 3, 297 (1964).
6. K. E. Van Holde, and R. L. Baldwin, J Phys. dem. 62, 734 (1958).
7. Р. L. Рг^^, E. I. ^кШриЬ, and V. M. Tisdenko, J. Mol. Biol. 127, 203 (1979).
8. S. J. Edelstein, and H. K. Sdadman, J.Biol.dem. 242, 306 (1967).
и
БИОФИЗИКА том 54 вып.6 2009
1014
TH^EHKQ
Fibrillar Part of the C1q Factor from the Complement System Has a Great Amount of Bound Water
V.M. Tishchenko
Institute of Biological Instrumentation, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia
The mass of sClq-CLR fragments from the fibrillar part of the C1q factor from the complement system was determined using high- and low-rate centrifugation. It is shown that this value is essentially higher than the value expected from the amino acid and hydrocarbon compositions. In addition, these fragments have an unusually high partial specific volume. These data support the earlier suggested model according to which the N-terminal part of the fibrillar structure contains an abnormal large amount of bound water.
Key words: C1q , fibrillar fragment, bound water
BHQ®H3HKA tom 54 Bbm.6 2009
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.