ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 1, с. 101-108
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.174:597.94
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ УГЛОЗУБОВ РОДА Salamandrella ПО ДАННЫМ ОБ ИЗМЕНЧИВОСТИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ
© 2015 г. Б. А. Малярчук, М. В. Деренко, Г. А. Денисова
Институт биологических проблем Севера Дальневосточного отделения Российской академии наук, Магадан 685000 e-mail: malyarchuk@ibpn.ru Поступила в редакцию 28.05.2014 г.
Основываясь на данных об изменчивости нуклеотидных последовательностей трех генов ядерного генома (BDNF,, POMC и RAG1), исследованы филогенетические взаимоотношения у углозубов рода Salamandrella — сибирского углозуба (S. keyserlingii) и углозуба Шренка (S. schrenckii). У представителей обоих видов выявлен высокий уровень гетерозиготности, обусловленный внутривидовым полиморфизмом. Фиксированные межвидовые различия выявлены только в одной нуклеотидной позиции гена RAG1, и, соответственно, уровень межвидовой дивергенции по трем генам составил всего 0.04%. Результаты исследования полиморфизма гена RAG1 на всем ареале S. keyserlingii показали, что к северу от Приамурья (на западе и северо-востоке Сибири) максимальное распространение получил лишь один вариант гена, кодирующий измененную форму рекомбиназы RAG1. Возможно, что изменения гена RAG1 у сибирского углозуба имеют адаптивную природу. Вместе с тем на территории Еврейской автономной области, где проходит одна из границ ареалов двух видов углозубов, нами выявлены случаи межвидовой гибридизации.
DOI: 10.7868/S0016675815010075
Углозубы рода Salamandrella имеют самый широкий ареал в сравнении со всеми другими амфибиями Палеарктики. Основываясь на данных об изменчивости митохондриальной ДНК (мтДНК), рядом авторов было показано наличие двух видов углозубов [1—6]. Ареал сибирского углозуба (S. keyserlingii Dybowski, 1870) простирается от северо-востока европейской части России и севера Казахстана, Монголии, Китая, Кореи и Японии вплоть до Чукотки [3, 5]. Сибирский углозуб является прекрасной моделью для изучения адаптивных стратегий широкоареальных видов, поскольку этот вид переносит без ущерба охлаждение до —35°С и способен, таким образом, переживать длительные и суровые сибирские зимы [7]. Ареал критического вида — углозуба Шренка (S. schrenckii Strauch, 1870), намного меньше; он охватывает почти всю территорию Юго-Востока России к югу от Амура и север КНДР, а также северо-восточные территории Китая (провинции Гирин и Хэйлунцзян) [4].
Видовой статус углозубов рода Salamandrella подтвержден результатами аллозимного анализа [2], а также результатами исследования полиморфизма трех генов (BDNF, POMC и RAG1) ядерного генома (яДНК) [8]. Вместе с тем отсутствие данных о полиморфизме ядерных генов углозуба Шренка в базе данных GenBank и дефицит таковых сведений для сибирского углозуба из российских популяций препятствуют формированию
представлений о филогенетических взаимоотношениях углозубов рода 8а1атап^в11а и об эволюции углозубовых (семейство НупоЪИёае) в целом. В настоящей работе нами получены данные об изменчивости трех ядерных генов (ЯБЫЕ, РОМС и ЯЛ01) у представителей двух видов рода 8а1атап-йгвИа с установленными нами ранее гаплотипами мтДНК, в соответствии с которыми изученные экземпляры были отнесены к тому или иному виду.
Целью исследования был поиск видоспеци-фичных вариантов полиморфизма в ядерных генах у представителей рода Ба1атапйгвИа. Кроме этого, нами проанализирован полиморфизм гена ЯЛ01 в выборке углозубов Шренка (по мтДНК) из популяции, расположенной в Еврейской автономной области и окруженной, согласно данным работы [4], популяциями 8. кву8вгНщП (по мтДНК). Это позволило нам получить доказательства межвидовой гибридизации у углозубов рода БаЫтапйгвИа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы углозубов рода 8а1атап^в11а были собраны во время полевых работ 2004—2010 гг. на территории Приморского и Хабаровского краев, Еврейской автономной области, Сахалина, Магаданской области, Якутии, Чукотки, Камчатки, Томской и Свердловской областей (рис. 1). Геномную ДНК выделяли из эмбрионов и личинок,
Рис. 1. Географическое распространение исследованных образцов углозубов рода Salamandrella на территории Северной Евразии. Серым цветом показан ареал сибирского углозуба. Образцы собраны на территории Свердловской области (номер 5), Томской области (7), Камчатки (2), Чукотки (15), Якутии (1, 4), Магаданской области (3, 14), Сахалина (12), Еврейской АО (6, 20, 27), Хабаровского края (8, 9, 10, 11, 13, 16, 17, 18, 22, 25, 28) и Приморского края (21, 23, 24, 26, 29). Образец из провинции Хэйлунцзян Северо-Восточного Китая (по данным работы [10]) отмечен номером 19. Видовая принадлежность образцов указана в соответствии с результатами анализа полиморфизма мтДНК.
замороженных или фиксированных в 70%-ном спирте. Для выделения ДНК применяли стандартный метод, включающий лизис ткани в 1%-ном растворе додецилсульфата натрия в присутствии протеиназы К (Sigma, США) и очистку фенолом и хлороформом. Поскольку указанные виды не различаются морфологически, то их видовую идентификацию проводили с помощью анализа изменчивости гена цитохрома b мтДНК, как описано нами ранее [1, 4, 5].
В качестве маркеров яДНК использовали одно-копийные белок-кодирующие гены субъединицы 1 рекомбиназы (RAG1; 1376 пн), нейротропного фактора мозга (BDNF; 742 пн) и проопиомеланокорти-на (POMC; 533 пн). Для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) генов BDNF и POMC использовали предложенные в работе [9] праймеры BDNF_DRV_F1/ BDNF_DRV_R1 и POMC_DRV_F1/POMC_DRV_R1 соответственно. Нуклеотидные последовательности гена RAG1 получали из двух перекрывающихся участков ДНК, амплифицированных с помощью предложенных в работе [10] праймеров RAG1-1/RAG1-2
и RAG1-3/RAG1-4. В случае неудовлетворительной амплификации участка RAG1-3/RAG1-4 для ПЦР использовали праймеры RAG1-122 и RAG1-4. Нуклеотидную последовательность праймера RAG1-122 (5'-GTA-GATACAATCTCGAAACG- 3') определили с помощью программы Primer3 [11]. Для секвенирования ДНК использовали те же праймеры, что и для ПЦР, за исключением участка RAG1-122/ RAG1-4, для секвенирования которого использовали праймер RAG1-3. Нуклеотид-ные последовательности ДНК определяли с помощью наборов для циклического секвенирования Big Dye Terminator (Applied Biosystems, v. 3.1) на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США). Для выравнивания и анализа нуклеотидных последовательностей и проведения статистического и филогенетического анализа молекулярных данных применяли пакеты программ MEGA 5.05 [12] и Arlequin 3.5 [13].
Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности генов RAGl (номер в GenBank HM037736), BDNF (HM037761) и POMC (HM037786) у представителя S. keyserlingii из Се-
N
BDNF
POMC
RAG1
Гаплотип мтДНК
4
13 18 19 22 24 21 23
1 1 1
2 4 5 1 2 3 4 1 2 2 2 3 4 4 5 8 0 0 1
5 8 7 7 1 4 2 8 6 2 1 3 5 0 1 2 1 6 5 5 5
5 9 0 2 1 6 7 3 6 0 0 4 5 6 2 7 9 7 3 8 8
С А С А А 6 С Т т А А А G G С С С G С С А
С А С А А G С Y т А А А G G С С С G с с А
С А Y А R G с Y т А С А А G С С С G Y с А
с А Т А А R с Т т А С А А G Y с Y G С Y А
Y R С W R G Y С Y M С W А G С с С S с С G
С А с Т А G С С Y M с А А G С с с G с с G
с А с А А G с с С M с А А G С с с G с с G
с А с W А G с с с А с А А R с Y с G с с G
К К
к к s s s s
Рис. 2. Генотипы генов BDNF, POMC и RAG1 у углозубов рода Salamandrella. Номера образцов соответствуют таковым, указанным на рис. 1. Гетерозиготные позиции показаны в соответствии с номенклатурой IUPAC: Y = T/C, R = A/G, M = A/C, W = A/T, S = G/C. Серой тонировкой указаны видоспецифичные различия в позиции 1158 гена RAG1. Гап-лотипы мтДНК соответствуют сибирскому углозубу (K) и углозубу Шренка (S). Нумерация нуклеотидов соответствует таковой для последовательностей генов, помещенных в GenBank под номерами KJ855091 (для BDNF), KJ855092 (для POMC) и KJ855093 (для RAG1).
веро-Восточного Китая (провинция Хэйлунцзян) [10] (на рис. 1 этот образец указан под номером 19).
Для реконструкции гаплотипов из генотипов гена RAG1 использовали алгоритм ELB из пакета программ Arlequin 3.5 [13]. Медианные сети гаплотипов конструировали с помощью алгоритма MJ метода медианных сетей (www.fluxus-engineer-ing.com).
Для определения предкового статуса полиморфных вариантов гена RAG1 у углозубов рода Salamandrella использовали депонированные в GenBank нуклеотидные последовательности этого гена у представителей 14 видов из 8 родов семейства углозубовых (Hynobiidae) (номера в GenBank: HM037712—HM037717, HM037719, HM037726, HM037728-HM037732, HM037735). Полученные в настоящей работе нуклеотидные последовательности ядерных генов у углозубов рода Salamandrella депонированы в GenBank под номерами KJ855091-KJ855096.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 2 представлены результаты исследования полиморфизма генов BDNF, POMC и RAG1 у трех экземпляров сибирского углозуба и четырех экземпляров углозуба Шренка. Для сравнения взяты нуклеотидные последовательности этих генов у сибирского углозуба из Северо-Восточного Китая (образец № 19) согласно данным работы [10]. Как видно, исследованные особи углозубов рода Salamandrella характеризуются выраженным внутривидовым полиморфизмом. В каждом из изученных генов наблюдаются гетерозиготные позиции, однако фиксированные межвидовые различия обнаруживаются только в одной позиции гена RAG1 (позиция 1158). Во всех остальных случаях полиморфные позиции были выявлены только у одного из видов и ни разу не были обнаружены у двух видов сразу. Наличие общих аллелей у двух видов углозубов рода Salamandrella свидетельствует о сохранении предкового полимор-
N RAG1 полиморфизм Гаплотип
мтДНК
1111111
112222344457880000122 622135600121346555750 8 6060454 682792370381861 1-13 TAGAAGCGCCCCCGGCCCGAGC К
14 ....................R. к
15 ............т......... к
16-17 . . .M.R..........Y..... К
18 ... С . А..........Y..... К
19 ...C.A...Y.Y.....Y.... К
20 Y . RCWA ..Y..........G.. К
21 CM . С . А.............G. . S
22
23
24
25
26
27
28 29
Рис. 3. Генотипы гена RAG1 у углозубов рода Salamandrella. Обозначе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.