= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 575.174:582.284
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВИДОВ РОДА Pleurotus © 2015 г. А. А. Шнырева, А. В. Шнырева
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра микологии и альгологии, Москва 119991 e-mail: ashn@mail.ru Поступила в редакцию 23.05.2014 г.
Представлены результаты филогенетического анализа десяти видов рода Pleurotus. Филогенетическое дерево было построено на основе отсеквенированных ITS1-5.8S-ITS2 последовательностей кластера генов рДНК для 31 штамма вешенок из разных источников происхождения и 10 референс-ных последовательностей из ГенБанка. Показано монофилетическое происхождение видов рода Pleurotus. Оценены эволюционные дистанции между видами. Традиционный генетический анализ половой совместимости на основе мон-мон скрещиваний показал отсутствие репродуктивных барьеров внутри видового комплекса P. cornucopiae — P. euosmus. Несмотря на четко выраженную под-разделенность между коммерческими сортами и природными изолятами P. ostreatus на филограмме, репродуктивная изоляция (половая несовместимость) отсутствует между данными группами. Был выявлен общий аллель matB локуса половой совместимости у производственных сортов Sommer и L/4, свидетельствующий об общем происхождении штаммов.
DOI: 10.7868/S0016675815020137
Виды рода Pleurotus широко распространены в лесных биоценозах средней полосы России, а также многие из них культивируются в пищевых целях. По масштабам культивирования в мире ве-шенка устричная, Pleurotus ostreatus, занимает второе место после шампиньона Agaricus bisporus. Видовой состав рода довольно разнообразен. Большинство видов рода съедобны или условно съедобны. Многие виды представляют биотехнологическую и медицинскую ценность, так как обладают пулом ферментов семейства пероксидаз, а также, как показано, спиртовые и водные экстракты полисахаридов многих представителей данного рода обладают антиопухолевой и антиок-сидантной активностью [1—3].
Зачастую точное определение видов в пределах рода Pleurotus бывает затруднено в связи со схожестью морфологических характеристик, особенно если речь идет о комплексных видах, представленных интерстерильными группами. Морфология плодовых тел также отличается непостоянством при культивировании и, как показано, во многом зависит от условий выращивания [4—6]. Таким образом, классическое определение грибов на основе культурально-морфологических характеристик в некоторой степени уходит на второй план, тогда как все большую популярность приобретают молекулярные методы анализа. Для филогенетических исследований в царстве грибов в настоящее время предложено шесть универсальных генных областей: гены малой и большой субъединиц рибосомальных РНК (18S рРНК, 28S рРНК и 5.8S рРНК), фактор элонга-
ции пептидов (EF1) и два гена, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы II (RPB1 и RPB2) [7]. Наиболее часто используемыми в филогенетике грибов областями для межвидовых и внутривидовых сравнений являются транскрибируемые спейсерные области кластера генов рибосомальных РНК — ITS1 и ITS2 (internal transcribed spacers), фланкированные генами 18S рРНК и 28S рРНК, и ген 5.8S рРНК, прерывающий ITS последовательность.
Целью данной работы было проведение филогенетического анализа видов рода Pleurotus на основе ITS последовательностей, а также разрешение наиболее сложных видовых комплексов с помощью классического генетического анализа половой совместимости.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы, использованные в работе
Список штаммов вешенки, использованных в работе, представлен в табл. 1 с указанием источника происхождения каждого штамма. Отсекве-нированные ITS последовательности культивируемых штаммов Pleurotus были депонированы в ГенБанк под соответствующими номерами (табл. 1).
Культивирование штаммов вешенки
Культивирование штаммов проводили в чашках Петри на сусло-агаре (150 мл пивного сусла, 850 мл воды, 20 г агара) при 25°С в темноте.
Таблица 1. Список штаммов, использованных в работе
Вид Штаммы Происхождение Коллекции Номера ITS в ГенБанке
P. sajor-caju CS-32 Производственный штамм, Northwest Mycolog- МГУ JQ814757
ical Consultants, США
H-1 Производственный штамм, Amycel 3011 WUR JQ837470
H-2 Производственный штамм, Le Champion 29, WUR JQ837471
Франция
P. pulmonarius 06-1 Дикорастущий изолят ЗБС МГУ, Московская обл. МГУ JQ837472
ZBS2012 » МГУ KF932728
14d » МГУ JQ837473
P. ostreatus M-9 Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ JQ837474
M-8 » МГУ JQ837476
38d Дикорастущий изолят, ЗБС МГУ, Московская обл. МГУ JQ837475
H-5 Изолят из экстремального местообитания WUR KF932726
32GH, Венгрия
H-8 Монокарион PC15, полученный из производ- WUR JQ837478
ственного штамма
H-9 Монокарион EP57, полученный из производ- WUR JQ837479
ственного штамма
#54 Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ —
#55 » МГУ —
L/4 Производственный штамм, г. Львов, Украина МГУ KF932729
Sommer Производственный штамм, Россия МГУ -
P. djamor H-10 Производственный штамм, Россия МГУ JQ837488
Z1 » МГУ JQ837487
1526 Дикорастущий изолят ИБиХ KF932719
P. eryngii H-6 Производственный штамм, Le Lion PE, Франция WUR JQ837481
H-7 Производственный штамм, Somycel 3065, Syl- WUR KF932727
van, Франция
1504 Дикорастущий изолят ИБиХ KF932718
P. cornucopiae H-14 Производственный штамм, Россия МГУ JQ837484
82 Дикорастущий изолят ИБиХ KF932716
88 » ИБиХ KF932717
AG I/463 — CCBAS KF932721
AG IV/675 — CCBAS -
AG III/465 - CCBAS -
AG II/464 - CCBAS -
P. calyptratus C-1 Дикорастущий изолят, г. Москва МГУ JQ837485
1935 Дикорастущий изолят ИБиХ KF932720
2933 » GöU KF932730
P. citrinopileatus AG 30015/691 - CCBAS KF932725
P. cystidiosus AG 55/466 - CCBAS FJ608592
P. dryinus AG I/467 — CCBAS KF932722
AG II/468 - CCBAS KF932723
AG III/470 - CCBAS KF932724
Референсные штаммы, использованные в филогенетическом анализе
P. pulmonarius 4203 Дикорастущий изолят, Швеция TENN AY450349
P. ostreatus 6689 Дикорастущий изолят, Австрия TENN AY450345
P. djamor CBS100134 - CBS AY265821
P. eryngii C1 Дикорастущий изолят, Иран IK FJ514549
P. cornucopiae 8763 Дикорастущий изолят, Австрия TENN AY450341
P. euosmus CBS 307.29 — CBS EU424298
P. calyptratus 9065 Дикорастущий изолят, Австрия TENN AY450338
P. citrinopileatus ACCC51261 — CAAS EU424285
P. cystidiosus CBS 297.35 Дикорастущий изолят, США CBS AY315766
P. dryinus 7947 Дикорастущий изолят, Дания TENN AY450343
Примечание. Коллекции: МГУ — кафедра микологии и альгологии, МГУ им. М.В. Ломоносова; WUR — Plant Research International, University of Wageningen, Нидерланды; ИБиХ — Институт ботаники им. М.Г. Холодного, г. Киев, Украина; CCBAS — Culture Collection of Basidiomycetes, Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Чехия; GoU — Georg-August-University Gottingen, Германия; TENN — University of Tennessee Herbarium, США; CBS — CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Голландия; IK — Institute of Kalamata, National Agricultural Research Foundation, Греция; CAAS — Chinese Academy ofAg-ricultural Sciences, Intstitute of Agricultural Resources and Regional Planning, Китай.
Для получения мицелиальной биомассы штаммы культивировали в жидкой питательной среде, содержащей 1% дрожжевого экстракта и 1% глюкозы, в стационарных условиях при 25°С в темноте.
Споровые отпечатки получали из зрелых плодовых тел, выращенных в лабораторных условиях. Выгонку плодовых тел проводили согласно описанной ранее методике [8]. Плодовые тела срезали и помещали в стерильные чашки Петри для получения споровых отпечатков. У большинства видов плодовые тела с фертильным гимени-ем формировались непосредственно на дикарио-тическом мицелии, выращенном на чашках Петри с сусло-агаром при 23°С и 10-часовом периоде освещения.
Получение тестерных штаммов
Получение гаплоидных тестеров половой совместимости (типов спаривания) и определение аллелей факторов половой совместимости осуществляли согласно стандартной методике [9, 10]. В типе у базидиомицетов продуктами мейоза являются четыре гаплоидные базидиоспоры, созревающие в массе на базидиях в гимениальном слое плодовых тел. Грибы рода Pleurotus обладают тет-раполярной системой половой (гомогенной) совместимости, поэтому для формирования фертиль-ного дикариона необходимо слияние монобазидио-споровых гаплоидных (гомокариотических) изолятов, различающихся аллелями локусов половой совместимости (AxBx, AyBy), или гетероал-лельных по А- и ^-факторам типов спаривания (биполярный гетероталлизм), причем каждый из локусов половой совместимости имеет множественные аллели [11, 12]. Фертильный дикарион (диплоид) как результат миграции ядер между совместимыми по полу гомокариотическими ми-целиями легко идентифицировать по наличию регулярных, хорошо заметных пряжек в районе клеточных септ. Появление пряжек на мицелии в результате скрещивания гомокарионов (так называемые мон-мон скрещивания) фактически указывает на фертильность (половую совместимость) партнеров и их принадлежность к одному и тому же виду [11]. Отсутствие дикариотизации между скрещиваемыми гомокарионами указывает на то, что данные монобазидиоспоровые гаплоидные изоляты имеют одинаковые аллели локусов половой совместимости, или на то, что данные изоляты принадлежат репродуктивно изолированным интерстерильным группам (биологическим видам).
Выделение монобазидиоспоровых гаплоидных тестеров, гетероаллельных по А- и 5-факто-рам, проводили по методике, изложенной в предыдущих работах [8, 10, 13].
Выделение ДНК и амплификация ITS последовательностей
Выделение геномной ДНК из мицелия осуществляли по стандартным методикам с использованием жидкого азота [14, 15]. ДНК очищали переосаждением 96%-ным этанолом и использовали в дальнейшем в качестве матрицы для амплификации.
Амплификацию проводили на термоциклере Amply4 (Biokom) с использованием Taq-полиме-разы и пары стандартных праймеров: прямого ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') и обратного ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [16]. Реакцию проводили в общем объеме реакционной смеси 25 мкл со следующим составом реагентов: 10 нг геномно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.